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Luminiscencia Molecular
Temas a desarrollar
Clase 1
Introducción a los procesos luminiscentes.
Bandas de un espectro luminiscente.
Clase 2
Factores fisicoquímicos
luminiscente.
Análisis cuantitativo.
Efecto de filtro interno.
que
influyen
Clase 3
Instrumentos para medidas luminiscentes.
Luminiscencia: métodos y medidas.
en
la
emisión
Temas a desarrollar
Clase 4
Efecto solvente y tiempos de vida.
Clase 5
Apagamiento de los procesos luminiscentes.
Clase 6
Fosforescencia. Espectroscopia de luminiscencia en fase sólida:
sensores ópticos.
Quimioluminiscencia y luminiscencia sensibilizada.
Procesos luminiscentes
Los procesos luminiscentes se han observado en la
naturaleza desde tiempos ancestrales. Por ejemplo, el
brillo luminiscente en el océano en la noche y bajo
ciertas condiciones → dinoflagelados (algas)
Fotos de lagos
de Gippsland
(Australia) con
proliferación
masiva del
alga Noctulina
scintillans
(dinoflagelado
inofesivo para
la salud).
Fenómenos luminiscentes
también se aprecian en
distintas variedades de
hongos, insectos y
organismos marinos
Corales fluorescentes
Luciérnaga
Medusa Aequorea victoria
El término “luminiscencia”
lo introdujo por primera vez el
físico e historiador científico
alemán Eilhard Wiedemann
(1852-1928) en el año 1888
Luminescencia es la emisión de luz de una
sustancia (no producida por calor)
Clasificación
Incandescencia
Luz a partir de energía calórica. Ej: sol
Fotoluminiscencia: fluorescencia y
fosforescencia (radiación electromagnética)
Luminiscencia Quimio(bio)luminiscencia (reacción química)
Electroluminiscencia (corriente eléctrica)
Radioluminiscencia (energía nuclear)
Fotoluminescencia
Fluorescencia
El fenómeno de la
fluorescencia nos rodea
en la vida cotidiana:
sistemas de iluminación
tipo fluorescentes o luces
de neón, agua tónica que
brilla con un intenso
color azul turquesa bajo
la luz negra, tintas,
pinturas
y
joyas
fluorescentes, etc.
Fotoluminescencia
Fluorescencia
¿Cómo reconocemos que estamos observando fluorescencia?
Luz
incandenscente
Luz
ultravioleta
Pintura
fluorescente
Los pigmentos
sensibles a la luz UV
absorven la “luz
negra” y devuelven
al sistema luz visible.
El tiempo de vida de fluorescencia es muy corto y se observará
“fluorescencia” durante la irradiación con una luz adecuada
Fotoluminescencia
Fosforescencia
Las pinturas
fosforescentes se
usan también con
mucha frecuencia en
joyería, juguetería,
adornos, etc.
Fotoluminescencia
Fosforescencia
¿Cómo reconocemos que estamos observando fosforescencia?
Las moléculas fosforescentes emiten luz visible que persiste aún
en ausencia de la luz de excitación.
Luz incandescente Oscuridad
Oscuridad
El tiempo de vida de fosforescencia es más largo, y veremos la señal
después que la luz se apagó
Luminescencia
Fotoluminescencia
La diferencia “macroscópica” entre los dos principales
tipos de luminiscencia (fluorescencia y fosforescencia)
se relaciona con los tiempos del proceso de emisión
Fluorescencia: tipo de luminiscencia donde la
sustancia absorbe radiación y la re-emite
prácticamente en forma instantánea. La fluorescencia
cesa dentro de los 10−5 seg después que la fuente de
energía se apaga.
Fosforescencia: persiste por un tiempo después que
la molécula se expuso a la luz.
Desde el punto de vista analítico, las señales
luminiscentes se usan con propósitos cualitativos y
cuantitativos, y la medida de luz emitida por una
muestra da lugar a:
Espectroscopía de Luminiscencia Molecular
Nombre colectivo dado a 3 técnicas
espectroscópicas relacionadas: fluorescencia,
fosforescencia y quimioluminiscencia.
Antes de ver las aplicaciones
analíticas
de
los
procesos
luminiscentes,
revisaremos
los
principios teóricos relacionados con
estas señales.
Fotoluminescencia
Relajación
no-radiante
Absorbancia
S2
Estados
electrónicos
excitados S1
So
S2
S1
So
Estado fundamental
Singlete: Todos los electrones
en la molécula están apareados
Triplete: Un par de electrones
están desapareados
Luminescencia
regla de Kasha
singlete
singlete*
Nivel
excitado
de
menor
energía
triplete*
Diagrama de Jablonski
Diagrama parcial de niveles de energía de una molécula
fotoluminiscente
Relajación vibracional (10-12 - 10-15 s)
Conversión interna
S2
Cruce de sistemas
S1
T1
E
N
E
R
G
I
A
Absorción
F
(10-8 10-9 s)
(10-15 s)
S0
λ1
λ2
λ3
Conversión
externa
P
λ4
Diagrama de Jablonski
Disociación
A veces, los fotones
absorbidos tienen energía
suficiente para promover
a la molécula a un estado
de alta energía vibracional
que produce la ruptura
del enlace. La molécula se
disocia y no fluoresce
Diagrama de Jablonski
Pre-disociación
Se alcanza un nivel
vibracional de mucha
energía a través de
conversión interna. El
enlace se rompe y la
molécula disociada no
fluoresce
Diagrama de Jablonski
Posición relativa de las bandas en el espectro
RESUMEN DE LOS PROCESOS DE RELAJACIÓN
Relajación vibracional
Conversión interna
Relajación no radiante
Conversión externa
Cruce de sistemas
Disociación
Predisociación
Fluorescencia
Relajación radiante
Fosforescencia
Relajación no radiante
Relajación vibracional
Transferencia de exceso de E vibracional de la molécula
al solvente. Se refleja en un ligero incremento de la
temperatura del medio.
Conversión interna
Relaciona 2 estados electrónicos de = multiplicidad
(S2–S1, T2–T1, etc). Se solapan niveles vibracionales de =
E pero distintos niveles electrónicos.
Conversión externa
Choques de moléculas excitadas con moléculas de
solvente o vecinas.
Relajación no radiante
Cruce de sistemas
Transición entre estados de distinta multiplicidad de
espín.
Disociación
Excitación directa a un estado vibracional alto,
produciendo la ruptura del enlace.
Predisociación
Alcance de un estado vibracional alto a través de
conversión interna.
Relajación radiante
Fluorescencia
Emisión de radiación electromagnética a partir
del estado excitado singlete S1*
Fosforescencia
Emisión de radiación electromagnética a partir
del estado excitado triplete T1*
Rendimiento o eficiencia cuántica
Relación entre números de fotones emitidos y número
de fotones absorbidos
Φf =
kf
kf+kci+kce+kcs+kpd+kd
Γ
Φf =
Γ + knr
k: constante de velocidad
f: fluorescencia
ci: conversión interna
ce: conversión externa
cs: cruce entre sistemas
pd: predisociación
d: disociación
Γ : velocidad emisiva del fluoróforo
Knr : velocidad de decaimiento no radiante
Fluorescencia: bandas espectrales
Espectros de excitación y emisión
F
Corrimiento de Stokes
excitación
emisión
Diferencia (en
unidades de
frecuencia o longitud
de onda) entre el
máximo de excitación
y emisión
Longitud de onda
Fluorescencia: bandas espectrales
Espectros de excitación y emisión
El espectro de emisión se obtiene midiendo la
fluorescencia emitida por la muestra a distintas
longitudes de onda, manteniendo la luz de excitación a
longitud de onda constante.
En un espectro de excitación, la luz de excitación se
barre a través de distintas longitudes de onda,
manteniendo la luz de emisión a una longitud de onda
constante
Fluorescencia: bandas espectrales
Espectros de excitación y emisión
λem > λex
νex – νem
Si λem = λex
corrimiento de Stokes
F de resonancia (base de fluorescencia atómica)
Fluorescencia: bandas espectrales
Algunas preguntas sobre bandas espectrales en fluorescencia
¿Cuál es la diferencia entre el espectro de excitación y el de
absorbancia de una misma molécula? Son términos
intercambiables o son procesos completamente distintos?
S2
S1
So
absorción = excitación
El espectro de excitación es
generalmente muy similar al de
absorción. Las diferencias, si las hay,
se deben a factores instrumentales
(espectrofotómetro vs.
espectrofluorímetro)
Fluorescencia: bandas espectrales
Algunas preguntas sobre bandas espectrales en fluorescencia
¿En qué regiones del espectro aparecerá el espectro de
emisión si la molécula se excita con luz de distintas λ?
S1
S0
La relajación radiante siempre se produce
del nivel excitado con menor energía S1*
(regla de Kasha). Por lo tanto, la energía
emitida es siempre la misma
El espectro de emisión aparece en la misma
región espectral, independientemente de la
longitud de onda de excitación
Fluorescencia: bandas espectrales
Algunas preguntas sobre bandas espectrales en fluorescencia
La intensidad de la emisión se relaciona con la longitud
de onda de excitación, pero la distribución espectral
(posición del espectro de emisión) es siempre la misma
independientemente de la longitud de onda de
excitación
Fluorescencia: bandas espectrales
Algunas preguntas sobre bandas espectrales en fluorescencia
Ejemplo: un fluoróforo se excita a 3 longitudes de onda (EX1,
EX2 y EX3). Los perfiles de emisión obtenidos son idénticos,
pero la intensidad de fluorescencia decrece en el orden EM1
> EM2 > EM3, de acuerdo a la amplitud de la excitación.
Fluorescencia: bandas espectrales
Algunas preguntas sobre bandas espectrales en fluorescencia
¿Los espectros de excitación y emisión son imágenes especulares?
E
F
2
1
0
0-2
0-2
0-1
0-1
0-0 0-0
2
1
0
geometria
λ
Los niveles de energía vibracional de los estados fundamental y
excitado son similares. Si la probabilidad de transición entre, por ej.,
los niveles cero y 2 (0 →2) es la más alta, la transición de emisión
recíproca (2 → 0) es también altamente probable. Por lo tanto, estas
bandas tendrán intensidades (alturas) similares (el corrimiento entre
ambas está dado por pérdida de energía vibracional).
Fluorescencia: bandas espectrales
Algunas preguntas sobre bandas espectrales en fluorescencia
Ejemplo: Espectros de excitación y emisión del antraceno
F
λ
S1
0-2
S0
0-1 0-0
Fluorescencia: bandas espectrales
Existen excepciones a la imagen especular:
Promoción a distintos estados electrónicos excitados
(S1, S2) y emisión a partir de S1. Ejemplo: quinina
F
S2
S1
S0
λ
Fluorescencia: bandas espectrales
Existen excepciones a la imagen especular:
Transferencia de energía en estado excitado. Ejemplo:
formas tautoméricas que absorben radiación a distintas
longitudes de onda pero la emisión se produce desde el
nivel más estable
F
a*
b*
b
a
λ
Fluorescencia: bandas espectrales
Existen excepciones a la imagen especular:
Reordenamiento geométrico de los núcleos en
estado excitado (tiempos de vida largos del estado
excitado)
F
bifenilo
λ
Fluorescencia: bandas espectrales
Existen excepciones a la imagen especular:
Formación de complejo en estado excitado que emite
radiación (a alta cc del analito). Ejemplo: pireno
Espectro de emisión
Monómero (Cpireno = 9x10-5 M)
F
Excimero (Cpireno = 6x10-3 M)
F
λ
λ
pKa’ en estado excitado distinto al pKa en estado fundamental
HO
SO3
-O
-
SO3-
H+
pKa = 11
pKa* = 4
SO3-
SO3-
SO3-
SO3-
1-hidroxipireno 3,6,8 trisulfonato
pH = 1
350
400
pH = 13
450
En estado excitado el
OH es más ácido y la
emisión se produce
desde la especie
deprotonada.
pH = 1-13
500
550
λ
El espectro de
emisión es imagen
especular del
espectro de
absorción de la
forma
deprotonada
Otras bandas espectrales
Además de las bandas de fluorescencia, se pueden
observar otras bandas en el espectro de
fluorescencia, tales como las correspondientes a las
dispersiones Rayleigh y Raman
F
RAYLEIGH
FLUORESCENCIA
RAMAN
RAYLEIGH
2° orden
RAMAN
2° orden
λ
Otras bandas espectrales
Cuando la luz de excitación interacciona con moléculas
de solvente, estás moléculas se promueven a estados
vibracionales excitados.
Si la molécula de solvente se relaja emitiendo radiación,
esta radiación corresponde a la dispersión Rayleigh.
S1
S0
RAYLEIGH
La emisión Rayleigh posee la
misma energía que la luz
incidente
Otras bandas espectrales
En otras palabras, la banda Rayleigh aparece a la misma longitud de
onda que la banda de excitación
F
RAYLEIGH
EXCITACIÓN
280
300
EMISIÓN
320
340
λ
Para evitar la presencia del Rayleigh en el espectro de emisión, éste se
obtiene a una longitud de onda más larga que la usada para excitación.
Ej, si se excitó a 280 nm, el espectro de emisión se mide a partir de 290
ó 300 nm.
Otras bandas espectrales
Si las moléculas de solvente excitadas vibracionalmente
se relajan hasta el primer estado vibracional excitado
emitiendo radiación, esta radiación corresponde a la
dispersión Raman
El Raman siempre
S1
se ve a una
diferencia
constante de
número de onda en
S0
RAMAN
relación al número
La luz de dispersión Raman de onda de la
usualmente posee menor energía excitación.
que la luz incidente.
Otras bandas espectrales
Ejemplo: Una de las frecuencia vibracionales de la molécula de agua es 3851 cm-1.
¿Dónde aparecerá el Raman para este solvente si la muestra se excita
a 350 nm y a 436 nm?
S1
?
S0
Conversión de longitudes de onda de excitación a número de ondas
λex = 350 nm = 28571 cm-1 y λex = 436 nm = 22936 cm-1
Para calcular la posición del Raman, a cada número de onda de la excitación
se le resta la frecuencia de vibración del agua, y se re-convierten a nm
28571 – 3851 = 24720 cm-1 = 405 nm
22936 – 3851 = 19085 cm-1 = 524 nm
Otras bandas espectrales
En conclusión:
- cuando λex = 350 nm, el Raman aparecerá a 405 nm
- cuando λex = 436 nm, el Raman aparecerá a 524 nm
EX = 350
F
EX = 436 fluorescencia
superposición
R = 405
300
400
R = 524
500
600 λ
Si el analito
fluoresce próximo a
500 nm, no es
conveniente excitar
a 436 nm,
especialnete si la
señal es baja
Preguntas
1)
¿Cómo
pueden
identificarse
las
dispersiones Raman y Rayleigh en un
espectro de emisión de fluorescencia?
Preguntas
2) ¿Qué se entiende por efecto limitante de la
dispersión Raman cuando se suma a la medida de
F de la muestra?
Preguntas
3) ¿Cuáles son las herramientas de las que
dispone el analista para evitar la dispersión
Raman en un espectro de F?
Preguntas
4) Los desplazamientos Raman de algunos
solventes son los siguientes: ciclohexano, 2880
cm-1; etanol, 2920 cm-1; cloroformo, 3020 cm-1.
¿A qué longitud de onda aparecerá la banda
Raman para cada solvente, si la λ de excitación
es 254 nm?