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IUOPA
Diagnóstico molecular en Oncohematología
Milagros Balbín
Laboratorio de Oncología Molecular
Hospital Universitario Central de Asturias
[email protected]
Estudios genómicos en cáncer
Traslación de resultados a la clínica
lo s g e n e s e n e l
A D N ...
… p ro d u c e e l
fe n o tip o fin a l
de genotipo
a fenotipo.
… c o d if ic a n
p ro te ín a s ...
… c u y a e s tru c tu ra
c o n lle v a u n a f u n c ió n . . .
(antes)
… que sum ada
a l a m b ie n te ...
5 0 - 7 0 % s p lic in g a lte r n a tiv o s
2 5 % - 6 0 % d e s c o n o c id o s
A R N n o c o d if ic a n t e
1 0 m illo n e s S N P s
lo s g e n e s e n e l
A D N ...
… que pueden ser
d if e r e n t e s d e b id o a la
v a r ia b ilid a d . . .
… p ro d u c e n e l
f e n o tip o f in a l
.. c u a n d o s e e x p re s a n e n e l
m o m e n to y lu g a r a d e c u a d o s
u n te jid o
e x p re s a
e n tre 5 0 0 0 y
10000 genes
de genotipo
a fenotipo.
… c o d ific a n
p ro te ín a s ...
(ahora)
… fo r m a n r e d e s c o m p le ja s d e
in t e r a c c io n …
… s u s c e p t ib le s d e
s u f r ir m o d if ic a c io n e s
p o s t - tr a d u c c io n a le s …
...e n c o o p e r a c io n
c o n o tra s
p r o te in a s …
1 0 0 K - 5 0 0 K p r o t e in a s
… c u y a e s tru c tu ra
c o n lle v a u n a fu n c ió n ...
c a d a p r o t e í n a e s t a b le c e u n a
m e d ia d e 8 in t e r a c c io n e s
Estudios genómicos en cáncer
En la era post-genoma
Desarrollo de nueva tecnología
Estudios globales
Las alteraciones de origen genético se
pueden detectar a distintos niveles
En el DNA
Alteraciones cromosómicas
Cambios en el nº de copias de DNA
Inestabilidad de microsatélites
Cambios en la metilación
Mutaciones puntuales
En el RNA
Cambios en la expresión de genes
RNAs reguladores: microRNAs
En las mitocondrias
Mutaciones en el
DNA
En las proteínas
Receptores
Antígenos tumorales
Estados de fosforilación
Péptidos o proteínas liberadas a los fluidos
Arrays de expresión/ Arrays de SNPs
Estudios genómicos en cáncer
Tecnologías de secuenciación de nueva generación
Genome size
3000 Mb
Req'd coverage
6
12
600
96
57,600
312,500
454 FLX
250
400,000
100,000,000
360
3730
bp/read
Reads/run
bp/run
#/runs req'd
Cost per run
Total cost
$
48
$ 15,000,000
$
6,800
$ 2,448,000
20
Solexa
32
28,000,000
896,000,000
67
$
$
9,300
622,768
Secuenciación del genoma de una LAM
•
•
•
•
•
•
Mujer blanca de 57 años de edad
De novo M1 AML
100% blastos en la muestra de m.o. al diagnóstico
Recaida y exitus a los 11 meses
Citogenética normal
LOH no detectable en arrays de SNP / Affymetrix
Secuenciación muestra tumoral y muestra de piel
Resultados:
De 3.000.000 de SNV (single nucleotide variants)
30.000 nuevas variantes específicas del tumor
241 en regiones codificantes
181 alteraciones que dan lugar a cambio de aa
(152 falsos positivos)
14 validadas como variaciones en línea germinal (SNP)
8 validadas como mutaciones somáticas adquiridas
Mutaciones somáticas detectadas en la muestra de LAM
PTPRT
Protein fosfatasa
CDH24
PCLKC
Familia Protocadherinas/cadherinas
SLC15A1
Transportador de péptidos
GPR123
EBI2
Receptores acoplados a proteinas G
KNDC1 Factor intercambiador de nucleótidos de guanina
GRINL1B
Receptor de glutamato
NPM1
FLT3
Proteina nucleolar
Receptor Protein kinasa
Estudios genómicos en cáncer
Observación-comparación
Obtención de datos globales
Experimentación
Descripción
Guiados por una hipótesis previa
Síndromes mieloproliferativos
Diferenciación normal
Aumento de proliferación/supervivencia
Mastocitosis sistémica
Policitemia vera
Trombocitemia esencial
Síndrome hipereosinofílico
Leucemia mieloide crónica
Leucemia mielomonocítica crónica
Metaplasia mieloide/mielofibrosis
Alteraciones moleculares conocidas en estos síndromes (en 2005)
Mastocitosis sistémica
KIT D816V
Policitemia vera
?
Trombocitemia esencial
?
Síndrome hipereosinofílico
Leucemia mieloide crónica
Leucemia mielomonocítica crónica
Mielofibrosis primaria
FIP1L1-PDGFRA
BCR-ABL
TEL-PDGFRB
?
Búsqueda de genes implicados en los SMP
Cuatro estrategias diferentes
Vainchenker
Genómica funcional. Cultivos de células
eritroides derivadas de PV creciendo
independientemente de citokinas
Utilización de moléculas inhibidoras de vías
específicas de transducción de señales
Inhibición de JAK2 impedía la proliferación
eritroide.
Comprobación mediante experimentos de
siRNA que JAK2 es necesario para la la
expansión eritroide en ausencia de citokinas.
Kralovics y Skoda
Pérdida de heterozigosidad de 9p24 es un evento +/- común en
PV. LOH debida a disomía uniparental adquirida
Secuenciaron la mínima región de disomia uniparental e
identificaron un alelo mutante del gen JAK2
Búsqueda de genes implicados en los SMP
Hipótesis: PV, ET y MF podrían originarse por
mutaciones que activan tirosin kinasas
Baxter y Green
Resecuenciación de genes candidatos
Grupo de Gilliland
Secuenciación de TODAS las tirosin kinasas
(85) en 325 pacientes
The human kinome
STE
CK1
AGC
CAMK
CMGC
TK
TKL
58
32
Mutación G > T en JAK2 da lugar a la sustitución V617F
Wildtype / Cels T
G
Granulocitos (PV, TE, MP)
G/T
Baxter,….Green, Lancet 2005
James,…Vainchencker, Nature 2005
Kralovics,….Skoda, New Engl J Med, 2005
Levine,…Gilliland, Cancer Cell 2005
Qué es JAK2?
Just another kinase…
JANUS kinase…
Qué hace JAK2?
Via JAK-STAT
Cuando JAK2 tiene la mutación V617F
la via JAK-STAT siempre está activada
Receptor EPO
JAK2
Stat
P
P
StatStat
JAK2
Membrana celular
Stat
Núcleo celular
Activación de genes de
proliferación y supervivencia
Es JAK2 V617F un oncogen?
Estudios in vitro e in vivo con líneas
celulares y modelos animales
Modelo murino de SMP inducido por JAK2 V617F
Obtención de m.o. de un donante
Transfección de las células cultivadas con un
vector conteniendo JAK2V617F
LTR
JAK2 V617F
Transplante de las células
transfectadas en ratones
irradiados
IRES EGFP
LTR
JAK2 V617F genera SMP en ratones
Resultados:
Aparición de un SMP con
•
Marcada policitemia
•
Leucocitosis
•
Hematopoiesis extramedular
•
Ausencia de trombocitosis
JAK2 V617F causa fibrosis en la médula ósea
JAK2 V617F
JAK2 WT
JAK2 V617F
Una mutación -> Tres fenotipos
Dosis génica
Polimorfismos en otros genes
relacionados
Otras alteraciones
Prevalencia de JAK2V617F cuando se utilizan métodos
de detección sensibles (tipo PCR específica de alelo)
JAK2V617F
PV
>95%
TE
~50%
MF
~50%
~ 50% de los pacientes con TE y MF no tienen la mutación
JAK2V617F
Existen otras mutaciones relacionadas
JAK2 K539L
Inserciones y
deleciones en el
exon 12 de JAK2
5% Policitemia vera
y eritrocitosis i.
JAK2
Stat
JAK2
Stat
Existen otras mutaciones relacionadas
Receptores de citokinas (EPOR, MPL,GCSFR)
Gen MPL (Receptor de trombopoietina)
Mutaciones W515L, W515K, W515A
S505N
< 8 % TE (JAK2 V617F neg)
10 % MP (JAK2 V617F neg)
Distintos fenotipos clínicos asociados con estas mutaciones
Mutaciones en el exon 12 de JAK2
Policitemia
Leucocitosis variable
No trombocitosis
Mutaciones en el receptor de trombopoietina (MPL)
Pacientes con TE y mut W515 tienen
mayor nº de plaquetas y menor
hemoglobina que los JAKV617F+
Pacientes con MP y mut W515 presentan
anemia más severa
MPL W515L genera SMP en ratones
Resultados:
Aparición de un SMP con
•
Trombocitosis
•
Leucocitosis
•
Mielofibrosis
•
Ausencia de policitemia
Dos posibles modelos de patogénesis de los SMP
Kralovics (2008)
mutación
JAK2V617F
9pUPD
X
Célula
normal
XX
aparición fenotipo MPN
hematopoyesis clonal
mutación
desconocida
(del20q)
mutación
JAK2V617F
X
célula
normal
9pUPD
XX
aparición fenotipo MPN
hematopoyesis clonal
Tipos de estructuras clonales identificadas en neoplasias mieloproliferativas
Kralovics (2008)
Modelo de adquisición estocástica de mutaciones en la patogénesis de SMP
mutaciones con fenotipo clínico
JAK2
V617F
MPL
ex12
W515L S505N W515K
alteraciones sin fenotipo aparente
del20q
del13q
?
adquisición al azar en pacientes
aparición
fenotipo
Kralovics (2008)
aparición
fenotipo
Alteraciones moleculares conocidas en la actualidad
Mastocitosis sistémica
Policitemia vera
Trombocitemia esencial
KIT D816V
JAK2 V617F y exon 12
JAK2 V617F / MPLW515 + ?
Síndrome hipereosinofílico
FIP1L1-PDGFRA
Leucemia mieloide crónica
BCR-ABL
Leucemia mielomonocítica crónica
Mielofibrosis primaria
TEL-PDGFRB
JAK2 V617F / MPLW515 + ?
Otras alteraciones potencialmente implicadas en el desarrollo de los SMP
Cambios epigenéticos
Blood 2007 Abstract
Otras alteraciones potencialmente implicadas en el desarrollo de los SMP
Cambios en los perfiles de expresión de microRNAS
Granulocitos MFP vs control, PV, TE
miR-190 -> aumento expresión significativa
miR-31
miR-150 -> disminuída significativamente la expresión
miR-95
miR-182 y –183 aumento expresión en JAK V617F
Guglielmelli et al Exp Hematol 2007
Regulación del desarrollo hematopoyético por microRNAs
Estrategias terapéuticas en los SMP
Inhibición de la actividad Tirosin Kinasa
de JAK2 V617F
ATP
JAK2
V617F
Kinasa activa
Inhibidor de JAK2
JAK2
V617F
Kinasa inactiva
Inhibición de JAK2 V617F
Inhibidores selectivos
INCB01842447
Fase I/II en mielofiborosis
XLO1945
Fase I en mielofibrosis
TG10134841
Fase I/II en mielofiborosis
Inhibición de JAK2 V617F
Inhibidores no selectivos
Lestaurtinib (CEP-701) Inhibidor de Flt-3, TRKA
Fase 2 en mielofibrosis
Hexner et al Blood 2008 vol111
VX680 (Inhibidor de aurora kinasas, ABL, Flt-3)
Fase I en mielofibrosis
CP-690,550 (Inhibidor de JAK3)
Inmunosupresor
Inhibición de JAK2 V617F
Terapia epigenética
ITF2357 (Inhibidor de HDACi -Histonas
deacetilasas) Fase II
Guerini et al Leukemia 2008 vol 22
5-aza 2 desoxicitidina (agente hipometilante)
Fase II
Shi et al Cancer Res 2007
Detección de JAK2 V617F
Introducción como apoyo diagnóstico
2007 Se propone la revisión los criterios WHO e incluir su
determinación como uno de los criterios mayores en el
diagnóstico de Policitemia vera, mielofibrosis primaria y
trombocitemia esencial
Detección de JAK2 V617F en la práctica
Amplificación específica de alelos
1
A
T
2
G
C
3
Baxter et al ( 2005)
2
Detección de JAK2 V617F en nuestro laboratorio
Año 2006
Nº de
solicitudes
JAK2 V617F
positivo
JAK2 V617F
negativo
143
79 (55%)
64 (42%)
159 (53%)
136 (46%)
147 (51%)
140 (48%)
(12% solic
BCR-ABL)
Año 2007
295
(10% solic
BCR-ABL)
Año 2008
287
(27% solic
BCR-ABL)
Actividad del Laboratorio de Oncología Molecular
Nº determinaciones año 2008
JAK-2
JAK-2/BCR-ABL
JAK-2
14%
BCR-ABL
14%
4%
6%
5%
3%
BCR-ABL Q
Monoclonalidad/linfoma
K-RAS
LAM
Quimer.
6%
2%
2%
4%
15%
11%
K-RAS
14%
Monocl/Linfoma
BCR-ABL Q
LAProm
LAL
QUIMERISMO
C. MAMA FAMILIAR
C.COLON FAMILIAR
OTROS
Actividad del Laboratorio de Oncología Molecular
Procedencia de las muestras
600
400
Año 2006
Año 2007
Año 2008
200
0
Hematologi
a
AP
Genetica
Otros
HUCA
Cabueñes
San
Agustín
Otros ext
Año 2006
329
41
26
50
65
52
12
Año 2007
434
70
45
79
178
131
96
Año 2008
533
118
38
323
176
120
138
Actividad del Laboratorio de Oncología Molecular
Iñigo Santamaría
Ana S. Pitiot
Irene Centeno
Marta Glez Alvarado
Olaya Izquierdo
¿Dónde está mi ciencia?
…He perseguido un simulacro de orden
cuando debía saber muy bien que no existe el
orden en el Universo
Umberto Eco