1. No category

 Estudio de la excreción de compuestos fenólicos en el alga parda Cystoseira tamariscifolia. ¿Un proceso fotorregulado? Abdala Díaz, RT ; Gala González; Calvo Orquín J; y López Figueroa F Viña del Mar, 27 de Octubre de 2015 1 1. INTRODUCCIÓN Debido al deterioro de la capa de ozono, la radiación de onda corta puede llegar a la biosfera y afectar negativamente a los organismos. Es de esperar que ante nuevas anomalías climáticas los organismos desarrollen mecanismos de defensa y estrategias evolutivas diferentes. Ante el incremento de la radiación , las algas han desarrollado mecanismos de defensa. METABOLITOS SECUNDARIOS: §  Sustancias bioactivas. §  Son productos de procesos enzimáticos. §  Distribución restringida. §  No implicados en el desarrollo y mantenimiento de un organismo. 2/18 1. INTRODUCCIÓN Las algas pardas poseen un alto contenido en compuestos fenólicos (florotaninos). COMPUESTOS FENÓLICOS: §  Importancia: capacidad para absorber en el rango de UV Fotoprotectores §  Empaquetados en los fisoides, constituyen el componente mayoritario del citoplasma de algas pardas (Schoenwaelder y Clayton, 1999). §  Variaciones estacionales (Pavia et al., 1997) y diarias (Abdala-­‐Díaz et al., 2006). §  Papel biológico de defensa química ante situaciones de estrés. §  Variaciones inter e intra-­‐específica de su concentración. Cystoseira tamariscifolia: alga parda (Phaeophyceae) de la zona intermareal. 3/18 HIPÓTESIS ENZIMA FENOLSULFATASA (EC 3.1.6.1) §  Responsable de la hidrólisis de los enlaces sulfato. §  Posiblemente implicada en la excreción de compuestos fenólicos. §  Se desconoce la implicación en la degradación de fenoles. OH O–SO3H FENOL SULFOTRANSFERASA + PAPS fenil-­‐sulfato fenol O–SO3H OH + SO4 FENOLSULFATASA + H2O fenil-­‐sulfato fenol 4/18 2. OBJETIVO 1.  Evaluar el papel fotorregulador de la radiación solar en la producción y excreción de compuestos fenólicos en el alga parda Cystoseira tamariscifolia. 2.  Estudiar la influencia de diferentes intensidades y calidades lumínicas (UV y PAR) sobre la acumulación, producción y excreción de fenoles. 3.  Estudiar la relación de la actividad de la enzima fenolsulfatasa con su implicación en la excreción de compuestos fenólicos. 5/18 Zona de estudio 3. METODOLOGÍA T amariscifolia . Provincia de Málaga . Playa d e l a A raña. Cystoseira Toma de muestras y material biológico Cystoseira tamariscifolia (Hudson, Papenfuss, 1950), orden Fucales, género Cystoseira. Recolección de muestras y mantenimiento en frío hasta el laboratorio. Aclimatación a 15 ºC durante 24 h en agua filtrada de la zona de muestreo. 6/18 Usamos la parte apical (1g PS) debido a su mayor contenido en compuestos fenólicos. 3. METODOLOGÍA Diseño experimental: Tratamientos 4 tratamientos en función de la disponibilidad de luz y radiación UV. § 
§ 
§ 
§ 
A: bajo PAR+UV B: bajo PAR sin UV + Filtro C: alto PAR+UV D: alto PAR sin UV
+ Filtro 12 biorreactores, 1L de capacidad. Cámara de cultivo 25ºC, control de pH. Irradiancia controlada y aireación continua. Toma de muestras: 0, 3, 6, 19, 25, 42, 48, 60, 72 y 132 h. 7/18 FLUORESCENT LAMP(PAR)
Q-PANEL 340 (UV)
0,8
W m-2
0,6
0,4
0,2
0,0
300
400
500
600
700
Wavelength (nm)
Bajo PAR=50 μmol de fotones m-­‐2 s -­‐1 Bajo UVA= 3,5 Wm2/UVB=597 mWm2 Alto PAR=500 μmol de fotones m-­‐2 s-­‐1 Alto UVA=6,4 Wm2/UVB=1044 mWm2 PAR: Philips, Lámpara fluorescente UV: Q-­‐Panel 340 8/18 Tratamientos 1,0
A: bajo PAR+UV B: bajo PAR sin UV + Filtro C: alto PAR+UV D: alto PAR sin UV+ Filtro 3. METODOLOGÍA Análisis bioquímicos §  Cuantificación de fenoles excretados: 1 mL de agua del medio. §  Cuantificación de fenoles internos: método Folin Ciocalteu (1927). §  Cuantificación de la concentración de clorofila a: extracción com N,N-­‐
dimetilformamida (DMF). Determinación del estado fisiológico del alga Forma no intrusiva de determinación del estado fisiológico del alga: medidas de la capacidad fotosintética asociada al fotosistema II mediante la aplicación de Pulsos de Amplitud Modulada. 9/18 ACTIVIDAD FENOLSULFATASA §  Cuantificación de la actividad fenolsulfatasa: formación de un cromóforo que evidencia la actividad enzimática. + 2 gotas NaOH 0.05g (PF) incubados en solución estándar-­‐
H2O, 24 h a 30ºC Se detiene la reacción añadiendo 2 gotas de NaOH El cambio de coloración evidencia la presencia de actividad enzimática 225 μL 0.4 M MES-­‐Tris, pH 6.2, 225 μL 2.22 mM p-­‐nitrocatecolsulfato, 600 μL de agua destilada (H2O) (d) 10/18 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Fenoles excretados 70
L PAR + UV
L PAR
H PAR + UV
H PAR
Phenolic excretion
(mg g-1 DW)
60
50
r2>0.96 Significativo Exposición a UV P>0.05 No significativo 40
30
20
r2≈0,96 10
0
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
Integrated radiation dosage (kJ m-2)
Nivel de irradiancia P<0.05 12/18 PROCESO FOTORREGULADO Posible mecanismo fotoprotector (filtro de luz) 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Fenoles internos 20
L PAR + UV
L PAR
18
Phenol content (mg g-1 DW)
Phenol content (mg g -1 DW)
20
16
14
12
10
8
6
H PAR+UV
H PAR
18
16
14
12
10
8
6
4
4
0
2000
4000
6000
8000
10000
0
12000
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
Integrated radiation dosage (KJ m-2)
Integrated radiation dosage (KJ m-2)
Correlación fenoles excretados-­‐fenoles internos -­‐0,527 Disminución de las reservas internas como respuesta al estrés: MECANISMO DE DEFENSA 13/18 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Actividad fenolsulfatasa 1000
Phenolsulphatase activity
(µM nitrocatechol g-1DW h-1)
Phenolsulphatase activity
(µM nitrocatechol g-1DW h-1)
1000
L PAR + UV
L PAR
900
800
700
600
500
H PAR + UV
H PAR
900
800
700
600
500
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0
Integrated radiation dosage (KJ m-2)
10000
20000
30000
40000
50000
60000
Integrated radiation dosage (KJ m-2)
Correlación entre fenoles internos y actividad fenolsulfatasa 0,416 La actividad fenolsulfatasa y el contenido interno de fenoles se encuentran íntimamente relacionados 14/18 70000
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Clorofila a 3,0
Chlorophyll a (mg g-1 DW)
Chlorophyll a (mg g-1 DW)
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
H PAR+UV
H PAR
2,5
2,0
1,5
1,0
L PAR + UV
L PAR
0,5
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
Integrated radiation dosage (KJ m-2)
Integrated radiation dosage (KJ m-2)
Fotoinhibición 15/18 70000
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Fluorescencia 0,65
0,60
160
B PAR+UV
B PAR
A PAR+UV
A PAR
B PAR+UV
B PAR
A PAR+UV
A PAR
140
120
0,55
ETRmax
Fv/Fm
0,50
100
80
60
0,45
40
0,40
0h
3h
6h
19h
25h
42h
48h
60h
72h
132h
0h
Tiempo (h)
3h
6h
19h
25h
42h
48h
60h
72h
132h
Tiempo (h)
§  Valores estables al finalizar en experimento. §  Mayor productividad fotosintética al no estar sometida a alta irradiancia o radiación UV. 16/18 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Excreción
Fenoles internos
Actividad fenolsulfatasa
Pigmentos (Cl a)
PC1 (59.2 %)
0,41
-0,61
-0,55
0,37
17/18 PC2 (27,8 %)
-0,65
-0,10
0,12
0,74
5. CONCLUSIONES 1. 
La excreción y producción de compuestos fenólicos se trata de un proceso fotorregulado en Cystoseira tamariscifolia. 2.  La radiación PAR es la principal estimuladora de la excreción de compuestos fenólicos, la influencia de radiación UV no es significativa . 3.  La actividad de la enzima fenolsulfatasa se encuentra correlacionada con el contenido interno de fenoles (0.416), lo que parece indicar que participa activamente en la excreción de los mismos. 18/18 19