1. No category

Modelo del metabolismo basal y biosíntesis
de beta glucanos en la microalga
Ochrophyta Nannochloropsis salina
Nicole Ehrenfeld
Escuela de Biotecnología, Universidad Santo Tomás
Centro de Investigación Austral Biotech
CLABA 2015
29 de Octubre
CENTRO DE
INVESTIGACION
AUSTRALBIOTECH
Austral Biotech S.A. · Av. Ejército 146, Torre C, Nivel -2 · Santiago
PYT-2013-0015
Inmunoestimulante para la industria
salmonera a partir de cultivos sustentables de
microalgas
Problema: Industria Salmonera
http://www.efeedlink.com/
Inmunoestimulantes
Componentes biológicos que estimulan el sistema
inmune.
β-glucanos
D-glucosa
Enlaces
β- 1,2
β- 1,3
β- 1,4
β- 1,6
Polisacáridos de D-glucosa
Importante Nutracéutico
β-glucanos de levadura
Levadura
β-1,3 y β-1,6 glucano ramificado
Fuentes de β-glucanos en algas
Algas Pardas
Diatomeas
Laminarina y crisolaminarina
β-1,3 y β-1,6 glucano ramificado
Euglenophytas
Paramilon
β-1,3 glucano no ramificado
Vacuolas
Marcaje con anticuerpo anti 1,3-βglucano
Pared
Celular
T. pseudonana
S. cerevisiae
C. fusiformis
P. tricornutum
Función celular 1,3-β-glucanos
500 nm
Myklestad & Granum, 2009
Nogami & Ohya, 2009
¿Por qué estudiar β-glucanos en
microalgas?
Gran diversidad de organismos
fotosintéticos.
Modificar fácilmente su composición
Alto valor nutricional y producción de
compuestos de interés comercial
Cultivo a gran escala en terrenos no cultivables
Ensayo en pez Zebra
B
SqET1
6 dpf
C
Carmen Gloria Feijoo, PhD
Laboratorio Biología del Desarrollo
Facultad de Ciencias Biológicas
Universidad Andrés Bello
Republica 217 cuarto piso
Santiago, Chile
http://dcb.unab.cl/dra-carmen-gloria-feijoo/
Pez en
ayunas
Peces
alimentados
Tg (mpx: GFP)i114
CTH
CTH
Ensayo en pez Zebra
Fish meal
C
B
Soya meal
SqET1
Ensayo en pez Zebra
Esquema general ensayo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
dpf
Desafio con
Edwardsiella
tarda
Cuantificación
Cuantificación
Inflamación intestinal
Mortalidad acumulada
4 días de alimentación
Resultados preliminares
Figura 1: Cuantificación de inflamación intestinal. A) Larva alimentada con dieta
control negativo correspondientes a pellet comercial para pez cebra o harina de
pescado. En rojo se demarca la zona de interés, que corresponde al intestino medio y
donde se realiza el conteo de neutrófilos. B) Larva alimentada con dieta control
positivo, que corresponde a harina de soya. TCH, territorio hematopoyético, lugar
donde se ubican neutrófilos en condiciones control.
AD4 si es inmunoestimulante
100
80
60
40
20
d
72
hp
d
60
hp
d
hp
48
36
hp
d
hp
24
hp
12
d
0
d
Tasa de mortalidad acumulada
Tasa de mortalidad 1era alimentación
FM control
FM desafio
SOYA control
SOYA desafio
SY+AD4 control
SY+AD4 desafio
FM+AD4 control
FM+AD4 desafio
SY+AD5 control
SY+AD5 desafio
FM+AD5 control
FM+AD5 desafio
Tiempo de monitoreo
Efectos de aditivo 4 y 5 en sobrevivencia de larvas desafiadas con Edwarsiella tarda. En colores oscuros se observan
los resultados obtenidos para larvas alimentadas con las diferentes dietas sin desafiar. En el mismo color, pero
algunos tonos mas claros se observan los resultados obtenidos para las mismas dietas en larvas desafiadas.
Resumen Resultados
Aditivo
Respuesta patógenos
Protector intestinal
n=1
n=2
n=3
n=1
n=2
n=3
1
✓
✓
✓
✗
✗
✗
2
✓
✓
✓
✗
✓
✗
3
✓
✗
✗
✗
✗
✗
4
✓
✓
✓
✓
✓
✗
5
✓
✓
✗
✗
✗
✗
8
✗
✗
✗
✗
✗
✗
✓
=
respuesta
positiva
✗
=
respuesta
negativa
Nannochloropsis
Phylum Ochrophyta
Clase Eustigmatophyceae
Familia Monodopsidaceae
Género Nannochloropsis
25 um
1 www.algabase.org.
2
Radakovits et al., 2012 Nature Comm.
Nanno- o Micro-chloropsis?
Nanno- o Micro-chloropsis?
http://irtsv.cea.fr/dsv/irtsv/PublishingImages/img/PCV_141.jpg
Vieler et al., 2012 PLOSgenetics
Andrea Telatin http://www.nannochloropsis.org
Bondades de Nannochloropsis
Vieler et al., 2012 PLOS Genetics
Transcriptoma Nannochloropsis salina
• El 2011 en AustralBiotech, se secuenció 2 librerías de
cDNA por Illumina y 1 librería normalizada de cDNA por
tecnología 454, con lo que se obtuvo un transcriptoma
con un total de 33.814 unigenes.
Resultados de
Ensambles
Pb totales
Total Contigs
Sólo Illumina
Ensamble Global
(+454)
30.766.617
26.446.262
53.237
33.814
Largo promedio
577,9
782,1
Mediana Largo
381
491
Contig + largo
7.896
11.213
Búsqueda de genes relacionados a la
biosínteis de β-glucano en el transcriptoma de
N.salina
Fotosíntesis
Gliceraldehido-3fosfato
β-D-fructosa-1,6-bifosfato
PFK
NSV4U003282
FBP
NSV4U000087
NSV4U003486
NSV4U003564
NSV4U002382
NSV4U005971
NSV4U007039
NSV4U004982
ALDO
NSV4U002539
NSV4U003415
NSV4U004492
NSV4U003311
NSV4U008255
NSV4U009959
D-Fructosa
FK
NSV4U011034
NSV4U013883
NSV4U004951
NSV4U013076
NSV4U007260
β-D-fructosa-6-fosfato
GPI
NSV4U000743
NSV4U000135
α-Glucosa-6-fosfato
D-Galactosa
GalK
NSV4U002931
Galactosa-1-fosfato
PGM
NSV4U001976
NSV4U002454
NSV4U001905
UGP/PGM
NSV4U000351
GK
NSV4U000492
NSV4U004736
Piruvato
PDH
NSV4U005412
NSV4U000689
NSV4U004641
NSV4U006503
NSV4U011793
NSV4U003533
NSV4U002923
NSV4U004043
NSV4U005789
NSV4U001988
NSV4U002095
NSV4U003296
NSV4U004913
NSV4U016491
NSV4U002210
NSV4U003069
NSV4U002661
NSV4U002661
Acetil-CoA
D-Glucosa
α-Glucosa-1-fosfato
USP
UGP/PGM
NSV4U001354
NSV4U000351
NSV4U006935/NSV4U011752/NSV4U015350
UGP
UDP-glucosa
NSV4U003665
USP
GalE
NSV4U001354
NSV4U007253
NSV4U006935/NSV4U011752/NSV4U015350
NSV4U003461
BG
NSV4U000775
NSV4U000922
NSV4U000577
NSV4U000778
NSV4U005896
NSV4U014916
NSV4U001067
NSV4U004335
ACCasa
NSV4U000018
NSV4U000012
NSV4U000019
Malonil-CoA
UDP-glucosa
BS
NSV4U000043/NSV4U003668
Celulosa
1,3-β-glucano lineal
SKN1-KRE6-like
NSV4U002129
1,3;1,6-β-glucano ramificado
(Crisolaminarina)
Oligosacaridos
Exo-BG
NSV4U000938
NSV4U001805
NSV4U018825
Endo-BG
NSV4U003979
NSV4U000691
NSV4U000318
Síntesis de
lípidos
Modelo
metabólico
basal
Conjunto de procesos y
reacciones bioquímicas
mínimas por las cuales
una célula obtiene la
energía y los nutrientes
que necesita para vivir
y
reproducirse
en
condiciones favorables.
Anderson et al., 2008. Molecular Systems Biology, Vol. 4, Article number 178; doi:10.1038/msb.2008.12
Nicolás Loira, Ph.D.
[email protected]
Modelos metabólico a escala
genómica
[Nookaew, 2008]
Nannochloropsis salina
model iNR890
Chlamydomonas reinhardtii
model iRC1080
C. reinhardtii genome
Pantograph
N. salina transcriptome
N. salina genome
[Wang, 2014]
[Loira, 2015]
N. salina
draft model
Ortología entre ambas especies
Se identificaron las secuencias ortólogas entre las
proteínas de C. reinhardtii y N. salina, a través de
los programas OrthoMCL e Inparanoid.
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Archivos .rel
Reconstrucción Automática
Lista de genes
ortólogos
Definición de
reacciones del
modelo metabólico
de C. reinhardtii
Primera versión del
modelo
• 1701 reacciones
conservadas
• 490 reacciones faltantes
33
Curación manual del modelo
X
Buscó ortólogos
en genomas
N. gaditana y
N. oceanica
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Incluyeron reacción
de transporte entre
organelos
X
X
X
X
Definieron rutas
alternativas a
reacciones
enzimáticas
X
X
X
X
Reasociaron
genes con
reacciones
X
Eliminaron las
reacciones
de biosíntesis
almidón
N. salina iNR890
modelo metabólico
C. reinhardtii
iRC1080
N. salina
draft
N. salina
iNR890
Reactions
2,190
1,282
1,927
Metabolites
1,068
1,706
1,621
Genes
1,080
671
890
10
10
8
Compartments
Automatic
Manual
curation
Knock
out
Otros macroelementos
Fuentes de
carbono
Luminocidad
Validación
experimental
Condiciones medio
4 μE (flourecent cool)
40 μE (flourecent cool)
480 μE (flourecent cool)
5 μE (flourecent warm)
15 μE (flourecent warm)
50 μE (flourecent warm)
100 μE (flourecent warm)
200 μE (flourecent warm)
450 μE (white led)
1200 μE (white led)
2100 μE (white led)
3000 μE (white led)
Red led 673 nm, mixotrophic
Red led 673 nm, autotrophic
Glucose (mixotrophic)
Glucose (heterotrophic)
Ethanol (heterotrophic)
Ethanol (mixotrophic)
Bicarbonato
Glicerol (mixotrophic)
Sodium
Nitrite
Phosphate
Phosphate
Nitrate
Nitrate
Amonium
Amonium
Sulfate
Urea levels
Urea
Nitrate reductase (ammonium)
Nitrate reductase (nitrite no2)
Nitrate reductase (nitrate no3)
Biomasa
in silico in vivo Coincidencia
no
no
no
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
no
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
no
no
no
si
si
si
si
si
si
si
si
si
no
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
si
no
VN
VN
FN
VP
VP
VP
VP
VP
VP
VP
VP
FP
VP
VP
VP
VP
VP
VP
VP
VP
VP
VP
FN
VP
VP
VP
VP
VP
VP
VP
VP
VP
VP
VN
Especie
N. sp
N. sp
N. sp
N. gaditana
N. gaditana
N. gaditana
N. gaditana
N. gaditana
N. gaditana
N. gaditana
N. gaditana
N. sp
N. sp
N. sp
N. sp
N. sp
N. sp
N. sp
N. gaditana
N. salina
N. oculata
N. sp
N. gaditana
N. salina
N. sp
N. salina
N. sp
N. salina
N. gaditana
N. gaditana
N. salina
N. sp
N. sp
N. sp
Modelo metabolico
Biomasa
Luz (hv)
CO2
Fuente N
Fuente Pi
Trazas
Metales
pH adecuado
Chl
Mit
Aplicaciones de modelo metabólico a escala
genómica
- Contextualizar datos omicos
(transcriptomica, metabolómica)
- Guiar ingeniería metabólica
- Guiar descubrimientos (saber
qué cosas nuevas buscar, como
genes no anotados)
- Descubrir propiedades de la red
misma (qué genes son críticos, o
cuales son los requisitos en el
medio para producir biomasa)
[Milne, 2009]
Conclusiones
Proyecto inmunoestimulante
• Se seleccionaron dos especies de microalgas que tienen
un efecto inmuno-modulador en larvas de pez cebra.
Modelo metabólico
• Utilizando un transcriptoma, construimos un modelo
metabólico de N. salina, capaz de generar biomasa y que
incluye 1927 reacciones y 891 genes
• Este modelo es capaz de predecir 32+5 resultados
experimentales de diversas especies de Nannochloropsis
• La metodología utilizada (Pantograph) demostró que es
posible construir modelos metabólicos sin necesitar de
genomas extensivamente curados
Perspectivas a corto plazo
Proyecto FIA
• Validar el efecto inmunomodulador en pruebas con
salmónidos
• Mejorar la productividad de las especies microalgales
• Analizar la potencialidad económica de este
inmunoestimulante
Modelo metabólico
• Montar protocolo de transformación (para validar
knockout)
• Continuar la validación y refinado del modelo para
predecir crecimiento con otras fuentes de carbono y/o
metabolitos (B-glucano).
Financiamiento
Agradecimientos
Carmen Gloria Feijoo, PhD
Pilar Ulloa, PhD
Laboratorio Biología del Desarrollo
http://dcb.unab.cl/dra-carmen-gloria-feijoo/
MUCHAS GRACIAS
[email protected]