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NOTA (Farmacología)
Acta Científica Venezolana, 51: 53–60, 2000
CUANTIFICACION DE AMIODARONA EN SUERO MEDIANTE
PRECIPITACION DE PROTEINAS SEGUIDA DE
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION CON
DETECCION ULTRAVIOLETA
Marcela Valencia 1, Varlin Zapata 1, Adela Bider 1 , Margarita Pérez-González 2 y Vito Lamanna 3
1. Unidad de Detección de Medicamentos y Química Clínica, Instituto de Medicina Experimental,
Apartado Postal 50587, Caracas 1050, Venezuela.
2. Cátedra de Patología General y Fisiopatología, Escuela de Medicina "Luis Razetti",
Apartado Postal 50587, Caracas 1050, Venezuela.
3. Cátedra de Farmacología, Escuela de Medicina "Luis Razetti", Apartado Postal 50587,
Caracas 1050, Venezuela.
Recibido: 15/09/98 ; Revisado: 25/03/99 ; Aceptado: 19/10/99
RESUMEN: Nos propusimos desarrollar un método para la medición de amiodarona en suero mediante cromatografia líquida de alta
resolución con detección ultravioleta, optimizando las condiciones analíticas descritas en la literatura y determinar las condiciones óptimas
de almacenamiento de la muestra, para la instalación de un servicio nacional de referencia. La preparación de la muestra consistió en la
adición de 2 partes de acetonitrilo a 1 parte de suero, agitación por 45 s, incubación a 24Æ C por 5 min, centrifugación a 6000 g durante
2 min e inyección de 20 L del sobrenadante al cromatógrafo. Utilizando una columna Bondapak CN RP (3,9 150 mm) a 45Æ C, con
una fase móvil compuesta por KH2 PO4 10 mM / metanol / acetonitrilo (40:37:23 v/v/v) a pH 3,5, bombeada a 0,6 mL/min, obtuvimos un
tiempo de retención de 4,9 min. La detección se realizó a 242 nm, y la cuantificación mediante comparación con estándares externos;
el límite de detección fue de 0,11 g/mL. La relación masa/respuesta fue lineal (r2 > 0,99) para inyecciones con masa nominal de 2,96
a 18930 ng, lo cual excede lo requerido para el monitoreo de amiodarona sérica (0,3 a 6,0 g/ml). La recuperación fue de 99,26%
2,84%. El almacenamiento a -16Æ C de muestras precipitadas evita la degradación de la droga. Este método resultó más eficiente, sencillo
y económico que otros ya descritos, manteniendo la sensibilidad, especificidad y linealidad requeridas para ser considerado un método
óptimo para la cuantificación de amiodarona en suero. Palabras clave: HPLC, amiodarona, antiarrítmicos, cuantificación, suero.
MEASUREMENT OF SERUM AMIODARONE BY PROTEIN PRECIPITATION
FOLLOWED BY HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH ULTRAVIOLET DETECTION
ABSTRACT: Our aim was to develop a quantitative method for serum amiodarone measurement using high performance liquid chromatography with ultraviolet photometric detection. We studied previous reports in the literature in order to obtain a simpler method to be
used routinely in our TDM unit. Sample preparation was based on protein precipitation adding 2 parts of acetonitrile to 1 part of serum,
followed by vortex-agitation for 45 s, incubation at 24Æ C for 5 min, and centrifugation at 6000
g for 2 min. Twenty microliters of the
supernatant was directly inyected into the chromatographic system. A Bondapak CN RP column (3.9 150 mm) at 45Æ C, with a mobile
phase consisting of KH2 P04 10 mM / methanol / acetonitrile (40:37:23 v/v/v), pH 3.5, were used. Eluting with a flow rate of 0.6 mL/mm
the retention time of amiodarone was approximately 4.9 min. Detection was performed at 242 nm and the quantification was made by
peak heigth comparison with external standards. The mass/response ratio is linear (r2 > 0.99) within a mass range of 2.96 to 18,930 ng
of injected amiodarone, which exceeds the requirements for the monitoring of serum levels (0.3 to 6.0 g/mL). Sample storage should be
done with acetonitrile-extracted sera at -16Æ C to avoid degradation. The method is very efficient, linear, sensitive and specific but it also
simpler and cheaper than others reported in the literature. Key Words: HPLC, amiodarone assay, antiarrythmic, drugs, serum.
INTRODUCCION
La amiodarona es un antiarrítmico excepcional, con diversas acciones farmacológicas, efectivo en el tratamiento
de un amplio espectro de alteraciones del ritmo cardíaco, siendo ampliamente utilizado para el tratamiento de
las taquiarritmias supraventriculares y ventriculares2;3;15 .
Es un compuesto muy hidrofóbico, base débil con pK de
6,6. Su absorción gastrointestinal es lenta e incompleta
y su biodisponibilidad es de sólo 30 a 65% debido a una
absorción incompleta y a un metabolismo de primer paso.
La amiodarona se une ampliamente a proteínas y a los
lípidos tisulares, distribuyéndose extensamente en el tejido adiposo8;13;18 . Como resultado de esto, el volumen de
distribución aparente de la droga es de 50-60 L/Kg, lo cual
hace que se requiera un largo período de carga antes de
que se evidencie su actividad antiarrítmica. La principal
vía de eliminación es el metabolismo hepático, lo cual da
origen a un metabolito activo, la desetilamiodarona, con
actividad equivalente a la droga madre5;6 . Su excreción
renal no es importante y no es necesario un ajuste de dosis en pacientes con alteraciones en la función renal17 . La
vida media de la amiodarona es variable y larga, con un
rango de 16 a 180 días8;13;18 .
La utilidad de hacer determinaciones de concentraciones plasmáticas de amiodarona es un tema controversial.
Existen autores que afirman que no son necesarias, ya
que existe una amplia variación interindividual en la relación dosis/concentración plasmática alcanzada y entre
esta última y los efectos terapéuticos y tóxicos3;13 . Otros
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Valencia, Zapata, Bider, Pérez-González y Lamanna
Tabla 1. Comportamiento del pico de amiodarona en función del
flujo de fase móvil.
Flujo (mL/min) Respuesta (AU) Retención (min) Separación
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
50938
49888
49970
49753
49811
7,29
5,84
4,89
4,20
3,68
Adecuada
Adecuada
Adecuada
Inadecuada
Inadecuada
autores señalan que lo anteriormente descrito, unido al
hecho de que la amiodarona presenta una biodisponibilidad variable y a que es potencialmente tóxica cuando
se utiliza en terapia crónica, son razones suficientes para justificar la realización de las determinaciones de las
mismas3;13;20 . Los escasos datos disponibles en la literatura indican una concentración plasmática efectiva mínima
de amiodarona entre 1 y 2 g/mL y que la frecuencia de
efectos tóxicos aumenta con concentraciones plasmáticas
superiores a 2,5 g/mL6;7 .
El 80% de los pacientes que reciben amiodarona presentan efectos secundarios, pero sólo 10-15% los presentan de tal gravedad que se justifica la suspensión de la
terapia. Algunos de los efectos secundarios parecen estar
relacionados con la dosis total del medicamento administrada a lo largo del tiempo, es decir, con la cantidad de
medicamento acumulado5 . Sin embargo, no siempre puede establecerse una correlación entre la dosis y el efecto
secundario observado3 .
Existen numerosos métodos descritos en la literatura para la detección de amiodarona en líquidos
biológicos1;4;7;9;10;12;14;16;19;20 . La mayoría de ellos están basados en la cromatografia líquida de alta resolución
(HPLC); sin embargo, estos métodos resultan complicados y costosos por la forma de extracción y porque la mayoría utiliza estándares internos para la cuantificación, los
cuales no siempre están disponibles comercialmente14 .
Esto ha ocasionado que, pese a la necesidad de definir
si existe una relación clara entre la dosis de amiodarona
administrada, el tiempo de administración y la aparición
de efectos tóxicos, los estudios farmacocinéticos son escasos si se comparan con la información existente en la
literatura para otros medicamentos cardiovasculares. Es
por ello que decidimos realizar un estudio profundo de las
metodologías de detección de amiodarona ya publicadas y
tratar de establecer una nueva que fuese lo más eficiente,
simple y económica posible.
MATERIALES Y METODOS
Reactivos
El clorhidrato de amiodarona, utilizado para la preparación
de estándares y sueros con amiodarona añadida, el EDTA,
el metabisulfito de sodio y el fosfato dihidrógeno de po-
Figura 1. A) Espectro obtenido a 4,89 min. La máxima absorbancia relativa fue aproximadamente a 241,5 nm. B) Cromatograma de un estándar de amiodarona (inyección de 47,325 ng);
detección a 242 nm.
tasio (KH2 PO4 ) fueron adquiridos a Sigma Chemical Co.,
EUA. El acetonitrilo, metanol, ácido fosfórico y ácido perclórico, grado HPLC, fueron adquiridos a Fisher Scientific
Co., EUA.
Obtención de suero humano
Muestras de sangre humana de voluntarios sanos, obtenidas mediante punción venosa antecubital, fueron recogidas en tubos Vacutainer de 6 mL sin anticoagulante, dejadas en reposo a temperatura ambiente durante 15 min y
centrifugadas a 1500 g durante 10 min a 4Æ C. Los sueros obtenidos fueron mezclados, colocados en tubos de
polipropileno sellados con Parafilm y utilizados frescos o
almacenados a -16 Æ C hasta el momento de su uso.
* Marca registrada
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Cuantificación de amiodarona mediante HPLC
Figura 2. Curva de calibración de amiodarona basada en la inyección de estándares de acetonitrilo.
Figura 3. Cromatogramas típicos del extracto en acetonitrilo de
un suero con amiodarona (1) y un suero blanco (2).
Sistema cromatográfico
Preparación de soluciones estándar
Se utilizó un equipo formado por una bomba Waters 600,
un inyector automático Waters 714 Plus y un detector de
arreglo de fotodiodo Waters 996, acoplados a un sistema
de adquisición y procesamiento de datos Millenium , adquiridos a Waters Associates, Millford, MA, EUA. Las condiciones cromatográficas usadas fueron una modificación
del método descrito por Pollak14 . Usamos una columna
Bondapak CN RP de 3,9 mm 150 mm (Waters Associates), mantenida a 45Æ C. La separación de la amiodarona se logró en condiciones isocráticas, con una fase
móvil compuesta por KH2 PO4 10 mM / metanol / acetonitrilo (40:37:23), ajustada con ácido fosfórico a un pH final
de 3,5, filtrada a través de membranas de nylon con poros
de 0,45 m y desgaseada mediante sonicación bajo vacío
(Waters solvent clarification kit). La detección se realizó
mediante barrido de 220 nm a 400 nm de longitud de onda
y la identidad del compuesto se confirmó mediante comparación espectral multidimensional. La cuantificación se
realizó a 242 nm – longitud de onda correspondiente a la
máxima absorbancia de la amiodarona – comparando la
densidad óptica de la muestra con la de estándares externos.
A partir de una solución madre de clorhidrato de amiodarona, 1 mg/mL en acetonitrilo, con una concentración de
amiodarona base de 946,5 g/mL, se preparó una solución de trabajo 1/100 que aporta 189,3 ng de la droga en
un volumen de inyección de 20 L. A partir de la solución
de trabajo, mediante diluciones seriadas 1:1 en acetonitrilo, se obtuvieron estándares con rango de concentraciones de 0,148 g/mL a 4,733 g/mL, equivalentes a la
inyección en columna de 2,958 a 94,650 ng en 20 L, con
los cuales se construyeron curvas de calibración de seis
niveles para la cuantificación.
Determinación del flujo óptimo
Se hicieron inyecciones de 189,3 ng de amiodarona en 20
L de acetonitrilo para obtener una curva de altura del pico
de amiodarona en función del flujo de fase móvil. Partiendo de 0,4 mL/min, flujo asociado a una buena separación
entre el pico de amiodarona y el frente, se repitió la corrida
incrementando éste en intervalos de 0,1 mL/min hasta un
máximo de 0,8 mL/min.
Estabilidad de las soluciones estándar
Extracción de las muestras
La preparación de las muestras consistió en precipitación
de proteínas mediante la adición de dos partes de acetonitrilo a una parte de suero, agitación en vórtex por 45 s,
incubación a 24Æ C durante 5 min, y centrifugación a 6000
g durante 2 min a 4Æ C. Para el análisis se inyectaron 20
L del sobrenadante en el sistema cromatográfico.
* Marca registrada
Para evaluar la posibilidad de reducir el uso de solventes orgánicos en algunos de los pasos del método, se
comparó la estabilidad de soluciones de amiodarona en
acetonitrilo, solvente orgánico apropiado para la preparación de soluciones de trabajo para la adición de estándar interno12 , con una solución acuosa (PCA) compuesta
por EDTA 0,1 mM, metabisulfito de sodio 0,2 mM y ácido
perclórico 0,67% v/v, la cual, además de ser una potente
mezcla antioxidante, permitió la disolución de la droga, la
cual es pobremente soluble en agua. A partir de la solución madre previamente descrita, se prepararon mezclas
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Valencia, Zapata, Bider, Pérez-González y Lamanna
patrones con amiodarona en nueve concentraciones entre
2,958 ng y 18930 ng. Se evaluó la linealidad de la curva
de calibración mediante el coeficiente de correlación lineal
r de Pearson.
Estabilidad de la droga en sueros y extractos
Figura 4. A) Recuperación de la droga en sueros con amiodarona añadida, inyectados inmediatamente después de la precipitación de proteínas (Control) y en sueros almacenados por cinco
días a diferentes temperaturas. * Diferencia significativa con respecto al grupo control; P < 0,05. B) Recuperación de la droga
en extractos conservados a -16 Æ C por 1, 3 ó 4 días. * Diferencia
significativa con respecto al día 0; P < 0,05. Los resultados fueron expresados como porcentaje con respecto a la masa nominal
inyectada.
1/10 (1893 ng/20 L) en acetonitrilo o PCA y se almacenaron a 4Æ C durante 96 h. Se comparó la altura del pico
de amiodarona en inyecciones de 20 L de cada solución
realizadas inmediatamente después de su preparación y
repetidas al final del período de almacenamiento.
Linealidad de la relación masa/respuesta
Se construyó una curva, representando la altura del pico de amiodarona, expresada en unidades de absorbancia (AU), en función de la masa inyectada en 20 L. Se
utilizaron como estándares acetonitrilo sin amiodarona y
La recuperación de la droga a partir de sueros con amiodarona añadida luego de la desproteinización fue estudiada mediante comparación con estándares externos. Se
prepararon 35 muestras de suero humano fresco con una
concentración de amiodarona de 3,786 g/mL que, después de la extracción descrita, equivale a la inyección en
columna de 25,24 ng de amiodarona y se cuantificó la
masa recuperada. Cinco muestras fueron sometidas al
proceso de extracción e inmediatamente inyectadas en el
cromatógrafo; tres grupos de diez muestras cada uno fueron almacenados durante cinco días a -16Æ C, 4Æ C ó 24Æ C,
y luego sometidos al proceso de extracción y cuantificación de amiodarona. Las muestras que fueron extraídas y
procesadas de inmediato, además de representar el grupo control en los experimento de degradación, permitieron
calcular la eficiencia del proceso de extracción, es decir,
la recuperación de la droga luego de la precipitación de
proteínas. Para estudiar la estabilidad de la droga en los
extractos, se realizó la precipitación con acetonitrilo de 20
muestras de suero humano con amiodarona añadida, similares a las descritas anteriormente. Los extractos fueron inyectados inmediatamente y 15 de ellos fueron separados en tres grupos de cinco muestras y conservados
durante 1, 3 ó 4 días a -16Æ C. El día correspondiente a
cada grupo, las muestras eran retiradas del congelador,
agitadas brevemente en vórtex e inyectadas nuevamente en el cromatógrafo. La cuantificación de amiodarona
en los extractos conservados se expresó como porcentaje con respecto a la masa nominal inyectada. En ambos
experimentos las diferencias entre los grupos fueron evaluadas mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA)
seguida de la prueba de Bonferroni cuando el ANOVA indicaba diferencias significativas. El criterio de significancia
estadística fue una P < 0,05.
Sensibilidad y especificidad analíticas
El límite de detección de este método, fue evaluado mediante la inyección de estándares con concentraciones decrecientes, mediante diluciones seriadas 1:1 en acetonitrilo a partir de una solución con 2,958 g de amiodarona en
20L, y comparando la altura del pico de amiodarona con
las oscilaciones de la línea de base (ruido).
Para evaluar la interferencia potencial de otros medicamentos en la cuantificación de la amiodarona se procesó
un patrón comercial para monitoreo de drogas terapéuticas (suero control Dade nivel 3), reconstituido a partir del
liofilizado según las instrucciones del fabricante, el cual
contiene concentraciones elevadas (tóxicas) de 19 fármacos diferentes comúnmente utilizados en la práctica clínica, pero no contiene amiodarona.
Cuantificación de amiodarona mediante HPLC
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Figura 6. Concentraciones séricas de amiodarona en un voluntario sano tras la administración oral de una dosis de 800 mg.
Figura 5. Cromatogramas de un patrón en acetonitrilo (1) y un
suero con amiodarona añadida (2). B) Suero control Dade nivel
3.
Uso potencial en experimentos farmacocinéticos
Se estudió la concentración sérica de amiodarona luego
de una dosis oral única de 800 mg en un voluntario sano,
con la finalidad de comprobar la aplicabilidad del método
a estudios farmacocinéticos. Se obtuvieron muestras de
sangre inmediatamente antes de la administración de la
droga, y 30 min, 1 h , 2 h, 4 h, 8 h, 12 h y 24 h después.
Cada muestra fue extraída inmediatamente después de
separar el suero, almacenada a -16Æ C, y fueron inyectadas, previa calibración del equipo, al finalizar extracción
de la última muestra.
RESULTADOS
Determinación del flujo óptimo
En el método descrito por Pollak14 se utilizó una columna
Bondapak CN RP de 250 mm de longitud, obteniéndose
una retención cercana a 8 min con un flujo de fase móvil
de 0,8 mL/min. Tomando esto como base, se predijo una
una retención cercana a 4,8 1 min para un flujo de 0,8
mL/min al usar una columna de 150 mm. Sin embargo, en
los cromatogramas iniciales, este flujo produjo una elución
temprana de la amiodarona (3,68 min), cuyo pico, identificado mediante comparación con un espectro patrón, no
se separó adecuadamente del frente. Se obtuvo una curva de respuesta en función del flujo (Tabla 1). Partimos de
un flujo relativamente bajo (0,4 mL/min), con el cual obtuvimos una buena resolución del pico de interés pero un
mayor tiempo de elución. Para obtener el mínimo tiempo
de elución que no comprometiese la resolución, incrementamos el flujo a razón de 0,1 mL/min. La respuesta teórica
esperada es una disminución del tiempo de retención y
un estrechamiento absoluto de la banda cromatográfica,
lo que condiciona un aumento de la altura del pico con relativa invariabilidad de su área. En nuestro caso observamos una disminución progresiva del tiempo de retención
sin elevación de la respuesta fotométrica, lo que sugiere
que el estrechamiento esperado de la banda fue contrarrestado por un efecto de difusión a lo largo de la columna.
Este efecto de difusión en algunos casos, puede ser tan
importante como para producir, paradójicamente, ensanchamiento relativo de la banda y disminución de la altura
del pico. A temperatura ambiente y en sistemas similares, esto es notable sólo a flujos mayores de 1,5 mL/min,
pero probablemente la corrida a 45Æ C permitió evidenciarlo a flujos menores. Seleccionamos como flujo óptimo a
utilizar 0,6 mL/min ya que nos ofrece el menor tiempo de
retención con adecuada resolución y no condicionó una
disminución importante de la altura absoluta del pico de
amiodarona. En la Figura 1 se muestra un cromatograma
típico, con detección a 242 nm, el cual muestra un pico
aislado con retención de 4,89 min cuyo barrido espectral
de 225 nm a 400 nm concordó con el espectro patrón de
la literatura consultada11 .
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Estabilidad de las soluciones estándar
Se comparó la estabilidad de soluciones de amiodarona
en acetonitrilo y PCA. La amiodarona fue estable en acetonitrilo, con una pérdida del 0,22% de la masa inicial en
96 horas, mientras que en PCA, la pérdida fue de 93,51%.
Linealidad de la relación masa/respuesta
Se construyó una curva, representando la altura del pico de amiodarona, expresada en unidades de absorbancia (AU), en función de la masa inyectada. La Figura 2
muestra los datos obtenidos en seis puntos entre 2,958 ng
y 94,65 ng de masa inyectada, quedando excluídos, debido a la escala utilizada, tres puntos adicionales correspondientes a 198,3 ng, 1893 ng y 18930 ng. La ecuación de la
regresión obtenida con los nueve datos fue y = 261,769x
+ 24,965, con un coeficiente de correlación r2 > 0,999.
Para los análisis posteriores se prepararon e inyectaron
los estándares correspondientes a una curva de calibración con los seis primeros puntos, equivalentes en suero
a un rango de concentraciones de 0,148 a 4,733 g/mL.
La curva de calibración así obtenida abarca el rango en el
que se espera se encuentran los niveles de amiodarona
en las muestras provenientes de los pacientes bajo tratamiento.
Características cromatográficas del extracto
Aunque la precipitación de proteínas con acetonitrilo no es
un método específico de extracción, la amiodarona, por
su carácter hidrofóbico, tiene un alto índice de retención
en columnas de fase reversa y elución tardía con respecto a la mayoría de los compuestos presentes en un suero
desproteinizado, lo que le proporciona selectividad a la separación cromatográfica. A pH 3,5, muy inferior al pK de la
amiodarona, el compuesto se encuentra ionizado en cerca
del 99,9%, lo que contribuye a una adecuada resolución.
En la Figura 3 se muestran cromatogramas superpuestos
correspondientes a un extracto de suero con amiodarona
añadida y suero blanco. Se observó la presencia del pico
de amiodarona en el primero de éstos y una línea de base
limpia en el segundo, en el tiempo de elución correspondiente.
Estabilidad de la droga en sueros y extractos
La recuperación de la droga en muestras de suero con
amiodarona añadida, inyectados inmediatamente después de la precipitación de proteínas fue de 25,053 ng
0,717 ng (promedio DE), lo que representa el 99,26
2,84% de la masa nominal contenida en las muestras
(Figura 4A). Se observó una degradación espontánea del
medicamento en los sueros almacenados por cinco días a
24Æ C, en los cuales la recuperación aparente fue de 69,07
2,01%. También se observó degradación espontánea
en sueros conservados en frío a 4Æ C (72,15 3,72%) y a
Valencia, Zapata, Bider, Pérez-González y Lamanna
(71,88 1,71%). El ANOVA indicó diferencia significativa entre los grupos (F(3;31) = 163,19; P < 0,001),
y la prueba de Bonferroni indicó degradación a todas las
temperaturas con respecto al control (P < 0,05).
La Figura 4B muestra los resultados de la cuantificación
de amiodarona en extractos de suero con patrón añadido
almacenados a -16Æ C durante 1, 3 ó 4 días, comparados
con extractos inyectados inmediatamente después de la
precipitación de proteínas. Se observa mayor estabilidad
de la droga en los extractos de acetonitrilo, ya que no hubo pérdidas de magnitud comparable a la de los sueros
conservados a cualquier temperatura. La presencia de
extractos con una masa aparente notablemente superior
al 100% de su cuantificación inicial sugiere la evaporación del acetonitrilo como factor potencial de inexactitud.
En las muestras correspondientes al día 4 (recuperación
de 112,5 0,8%) ocurrió exposición no intencional de las
muestras durante 2 h (los viales usandos en el inyector
automático tienen una abertura en su parte superior para
la entrada de la aguja). El ANOVA indicó diferencia significativa entre los grupos (F(3;19) = 28,46; P < 0,001), y
la prueba de Bonferroni indicó mayor concentración de las
muestras conservadas por 4 días (P < 0,05).
-16Æ C
Sensibilidad y especificidad del método
El límite de detección de este método, expresado como la
mínima cantidad de amiodarona que produce una relación
señal / ruido de 5:1, fue de 0,74 ng, cantidad equivalente
a la inyección de 20 L de un extracto de suero con una
concentración de 0,11 g/mL.
La Figura 5 nos muestra los resultados de la comparación de los cromatogramas de un patrón en acetonitrilo
(23,663 ng, equivalente a una concentración en suero de
3,549 g/mL), un suero con amiodarona añadida (0,574
g/mL) y el suero control Dade nivel 3. El sitio correspondiente al tiempo de retención de amiodarona está limpio
en el cromatograma de suero comercial.
Aplicaciones del método
Se estudió la concentración sérica de amiodarona luego
de una dosis oral única de 800 mg v.o. en un voluntario sano con la finalidad de comprobar la aplicabilidad del
método a estudios farmacocinéticos. La Figura 6 muestra los resultados obtenidos. El gráfico corresponde a lo
esperado para las condiciones del experimento, alcanzándose el pico de concentraciones plasmáticas a las 4 h de
la administración10 .
DISCUSION
Hemos tratado de desarrollar un método de detección de
amiodarona por HPLC con detección ultravioleta que, sin
perder sus necesarias características de sensibilidad, especificidad y linealidad, sea lo suficientemente simple, eficiente y relativamente económico como para ser usado en
el estudio rutinario de grandes grupos de pacientes. Esto,
Cuantificación de amiodarona mediante HPLC
desde el punto de vista farmacológico, permitirá valorar la
utilidad real de los niveles séricos como predictores de los
efectos terapéuticos y tóxicos de este antiarrítmico.
La mayoría de los métodos de determinación de amiodarona por HPLC y electroforesis capilar que se encuentran en la literatura requieren de una laboriosa extracción
en fase sólida7;14 , de una compleja extracción líquidolíquido1;10;20 , o de sistemas cromatográficos complejos.
Estos métodos de extracción hacen necesario el uso de
un estándar interno lo cual encarece, complica y agrega
fuentes de error en la preparación y cuantificación de las
muestras. El análogo bromurado de la amiodarona (L8040) utilizado como estándar interno en la mayoría de
los métodos, no está disponible comercialmente, y ninguna de las sustancias alternativas propuestas satisface los
requerimientos de un estándar interno ideal14 . Todo esto ha traído como consecuencia que la determinación de
amiodarona no pueda ser un análisis de rutina en las diferentes unidades de detección de medicamentos del mundo, a pesar de ser altamente necesaria y requerida por los
especialistas de la cardiología.
La precipitación de proteínas con acetonitrilo e inyección directa del sobrenadante produjo una recuperación
elevada y reproducible, cercana al 100%. Esto coincide
con lo descrito en la literatura acerca de las propiedades
de la desproteinización con solventes orgánicos9;11 . Este
es un método más sencillo y reproducible que la extracción
en fase sólida y la partición líquido-líquido y, puesto que el
proceso no involucra pasos con pérdida parcial del analito, evaporación o transferencia incompleta de volúmenes,
no es necesario el uso de estándar interno para estimar la
recuperación y corregir pérdidas. La precipitación de proteínas con acetonitrilo / suero 1:1 es incompleta, a menos
que se agreguen otros agentes precipitantes, como sulfato de zinc a una concentración final de 0,05%9 . Plomp y
col.12 utilizaron una solución de estándar interno en acetonitrilo para la precipitación de muestras de plasma, (mezcla 2:1), logrando una recuperación de amiodarona y de
L8040 cercanas a 100%. Las características de este método hacían innecesario el uso de estándar interno, y de
otros agentes precipitantes. En la práctica, comprobamos
que la mezcla acetonitrilo / suero 1:1 produjo un sobrenadante turbio después de la centrifugación, mientras que la
mezcla 2:1 produjo un sobrenadante cristalino, indicativo
de precipitación completa de coloides.
Aunque la precipitación de proteínas no es un método específico de extracción, el carácter hidrofóbico de la
amiodarona le confiere una elevada retención en columnas de fase reversa con respecto a la mayoría de los compuestos presentes en un suero desproteinizado, lo que le
proporciona selectividad a la separación cromatográfica.
Además, para muestras de origen humano se prefiere el
uso de columnas de fase reversa, debido a la posibilidad
de usar fases móviles acuosas y a una mayor facilidad de
equilibración y diversidad de aplicaciones4 .
Con la finalidad de hacer el método lo más económico
posible, escogimos la utilización de una fase móvil con un
alto contenido de agua, evitando así el uso de fases mó-
59
viles con más de un 80% de solventes orgánicos, que son
comunes en la literatura1;7;9;10;12;16 , y cuyo uso rutinario
implica costos, riesgos laborales y daños ecológicos potenciales mucho mayores. La sustitución de una columna
de 250 mm de longitud por una más corta (150 mm) también redujo directamente el costo de la fase estacionaria y
el volumen de solventes requeridos para la elución.
El tipo de detección utilizado (barrido espectrofotométrico y comparación espectral multidimensional) asegura la
identificación específica de la amiodarona. Debido a que
en los sueros de los pacientes es posible encontrar contaminantes que no estén completamente resueltos del pico
de la amiodarona, preferimos cuantificar por altura y no
por área bajo el pico; aunque es posible que los contaminantes afecten el area bajo el pico, es menos probable
que alteren su altura máxima.
La amiodarona fue estable en los extractos, pero no en
los sueros sin extraer conservados a temperatura ambiente o en frío. Nuestros resultados coinciden con lo reportado por Vuagnat y col.19 quienes encontraron que el nivel
sérico disminuye contínuamente a partir del primer día, independientemente de la temperatura de almacenamiento,
con pérdida del 23% en una semana. Para garantizar la
estabilidad y correcta cuantificación de las muestras de
suero de pacientes referidos a un laboratorio externo es
preferible la precipitación de la muestra con acetonitrilo y
su conservación en tubos herméticos, en lugar de la simple congelación del suero, antes de su envío al mismo.
Hay autores que asumen la estabilidad de la amiodarona
en suero1 , lo cual contradice los hallazgos descritos. Estos resultados podrían deberse a la comparación de muestras de suero congeladas por cinco meses con otras congeladas por un tiempo menor no especificado, sin estudios
de degradación a corto plazo usando sueros frescos como
control. Hasta el presente no se habían hecho recomendaciones con respecto a la conservación de este tipo de
muestras para su análisis cromatográfico posterior; dada
la inestabilidad de la droga en suero, esta es una contribución importante del presente estudio.
El método fue lineal para inyecciones comprendidas entre 2,958 ng y 18930 ng de amiodarona, con un coeficiente
de correlación r2 > 0,999. La calibración desde 0 ng hasta
95,65 ng abarca el rango en el que se espera se encuentran los niveles de amiodarona en las muestras provenientes de los pacientes bajo tratamiento.
El límite de detección de este método, expresado como
la mínima cantidad de amiodarona que produce una relación señal / ruido de 5:1, fue de 0,74 ng, cantidad equivalente a la inyección de 20 L de un extracto de suero con
una concentración de 0,11 g/mL, inferior a la concentración terapéutica mínima de la droga.
El análisis de un suero comercial con concentraciones
tóxicas de 19 fármacos, entre los que se encuentran algunos de uso frecuente en cardiología (digoxina, lidocaína, n-acetil-procainamida, procainamida, fenitoína, quinidina) no mostró picos con posibilidad de interferencia en
la cuantificación de amiodarona, particularmente si ésta
se hace por altura y no por área del pico. La capacidad
60
Valencia, Zapata, Bider, Pérez-González y Lamanna
de detectar el leve ascenso en la concentración plasmática de amiodarona 30 min después de una dosis única
vía oral, y de discriminar el perfil farmacocinético hasta las
24 h, sugiere que la sensibilidad del método es suficiente para su aplicación en estudios farmacocinéticos y de
monitoreo terapéutico. Lesko y col.10 hacen la misma afirmación sobre su método, utilizando dos perfiles, uno de
los cuales es muy similar al obtenido por nosotros. Durante el año de experiencia de detección de niveles séricos
de amiodarona en nuestra Unidad, con pacientes de diferentes centros cardiológicos de la ciudad de Caracas,
utilizando el método descrito, hemos realizado 73 determinaciones, encontrando un valor promedio 1,08 0,707
g/mL con un rango de valores que van desde 0,37 - 3,07
g/mL.
La elución en un tiempo menor de 5 min permite, en la
práctica, el análisis de hasta 60 muestras en 8 horas con
dos calibraciones diarias, lo que le confiere un adecuado
rendimiento para su uso en el laboratorio clínico. La posibilidad de usar cantidades muy pequeñas de muestra,
hasta un mínimo de 20 L de suero, le da gran flexibilidad al proceso de recolección de la muestra. El método
desarrollado, con una relación óptima entre costos y rendimiento, satisface las exigencias de sensibilidad, especificidad y precisión requeridas para el su uso rutinario en el
laboratorio clínico.
AGRADECIMIENTOS
Este estudio fue realizado gracias a la ayuda de Fundadiagnóstica.
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