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Espectrometría de masas
CG-EM CL-EM
Espectrometría de masas
Es una técnica instrumental sofisticada que
separa y detecta iones en fase gaseosa. Se
basa
en
ionizar
convirtiéndolas
en
moléculas
iones
gaseosas
(generalmente
cationes), que se separan al ser acelerados por
un analizador de masas: la separación se basa
en la distinta relación m/z de los iones.
Espectrómetro de masas
Componentes del instrumento
10-5 10-8 torr
Introducción
de la muestra
Fuente de
ionización
Separador
de masas
Sistema de
vacío
El acoplamiento
entre CG y CL
con EM se
analizará más
adelante
Detector
iónico
Procesador
de señal
Registrador
Fuentes de ionización
 Ionización por impacto electrónico
 Ionización química
 Fuente de bombardeo con átomos rápidos
 Desorción con láser
 Ionización a presión atmosférica:
- Electronebulización asistida con un gas: electrospray
- Ionización química a presión atmosférica
- Fotoionización a presión atmosférica
CL
Ionización por impacto electrónico
moléculas neutras gaseosas
placa de repulsión
haz de electrones (70 eV)
filamento de W
placas focalizadoras
placas aceleradoras
(4000 V)
Las moléculas
gaseosas son
bombardeadas por
un haz de electrones
de alta E cinética
generados por un
filamento de
tungsteno o renio
iones
M+e
M.+ + 2e
ion molecular
(alta energía
interna)
Ionización por impacto electrónico
El ión molecular tiene alta energía interna que se disipa por reacciones de
fragmentación y reordenamiento
+.
+.
Ionización por impacto electrónico
Molécula hipotética ABCD (A, B, C y D = átomos)
ABCD + e
ABCD.+ + 2 e
ABCD.+
A+ + BCD.
A. + BCD+
CD. + AB+
AB. + CD+
ABCD.+
ADBC.+
ABCD.+ + ABCD
BC+ + D
B + A+
A + B+
D + C+
C + D+
BC. + AD+
AD. + BC+
(ABCD)2.+
Fragmentación
del ion
molecular
Reordenamiento seguido
de fragmentación
BCD. + ABCDA+
Colisión seguida de
fragmentación
Ionización por impacto electrónico
¿Porqué se fija a un valor estándar de 70 eV?
 esta es la E electrónica a la cual ocurre la mayor
formación de iones.
 el espectro de masas cambia solo ligeramente con
cambios en las proximidades de esta energía.
 se obtiene mucha información estructural.
 la distribución de E interna de los iones formados es
prácticamente la misma para distintos instrumentos,
volviendo a los espectros virtualmente independientes del
equipo usado.
En condiciones establecidas (E del haz de
electrones constante) el patrón de
fragmentación es el mismo para el mismo analito
Ionización química
Las moléculas de analito son indirectamente ionizadas vía
una serie de reacciones con un gas reactivo
Gas reactivo: metano, isobutano, amoníaco [cámara de
ionización de “alta” presión a 10 torr (0.013 atm)]
CH4 + ê de alta energía
CH4+ y CH3+
CH4+ + CH4
CH5+ + CH3
CH3+ + CH4
C2H5+ + H2
moléculas
reactivas
Transferencia protónica entre molécula reactiva y analito
CH5+ + MH
MH2+ + CH4
C2H5+ + MH
M+ + C2H6
Separador de masas
Utiliza un campo eléctrico o magnético para
afectar la trayectoria o la velocidad de las
partículas cargadas
 EM de sector magnético
 EM de cuadrupolo
 EM de tiempo de vuelo
 EM de trampa iónica
Espectrómetro de masas de sector magnético
Instrumento
de sector
de 90o
Utiliza un electroimán para hacer que el haz de iones
de la fuente se muevan en una trayectoria circular de
180, 90 o 60 grados.
Espectrómetro de masas de sector magnético
Instrumento
de sector
de 90o
Los iones formados se aceleran a través de la
rendija B hacia el tubo analizador metálico (presión
= 10-7 torr). Se puede variar la fuerza del campo del
imán o el potencial de aceleración entre las rendijas
A y B.
Espectrómetro de masas de sector magnético
Instrumento
de sector
de 90o
Cada catión pasa a través de la rendija de salida y
cuando llega al detector se neutraliza con un electrón
(electrodo colector). La corriente necesaria para
neutralizar el haz de cationes es proporcional al
número de cationes que llegan al detector.
Espectrómetro de masas de sector magnético
Instrumento
de sector
de 90o
El espectro de masas es una representación de
esta corriente en función del número de masa
seleccionado por el campo.
Espectrómetro de masas de sector magnético
¿Cómo se separan los iones de distinta masa?
Cuando las placas aceleradoras aceleran un ion por aplicación de una
diferencia de potencial, el ion adquiere una energía cinética igual a:
Ecinética = ½
mv2
m : masa
v : velocidad de la partícula
z : carga
V : diferencia de potencial
= zV
v = (2zV/m)½
Por otro lado, si el ion circula perpendicularmente a un campo magnético B,
sobre él actúan fuerzas centrípeta y centrífuga igual a:
FM = Bzv
mv2/r = Bzv
FC = mv2/r
v = Bzr/m
FM : fuerza centrípeta
FC : fuerza centrífuga
B : campo magnético
r : radio de curvatura
Bzr/m = (2zV/m)½
m/z = B2r2/2V
Espectrómetro de masas de cuadrupolo
4 barras
metálicas cortas
de 6 mm de
diámetro,
paralelas entre
sí y dispuestas
simétricamente
alrededor del
haz de iones
Ø = 6 mm
Un par de barras
están conectadas al
polo positivo y el
otro par a la terminal
negativa. A las
barras se aplica un
voltaje cte que
genera una corriente
continua o directa y
potenciales de
corriente alterna de
radiofrecuencia
variable, desfasadas
180°.
Espectrómetro de masas de cuadrupolo
Ø = 6 mm
Los campos
eléctricos
combinados hacen
que los iones
oscilen alrededor de
su eje central de
trayectoria
haciéndolos seguir
trayectorias distintas
hacia el detector.
Solo llegan los iones
resonantes (con
determinada m/z)
que no colisionan
con las barras
Espectrómetro de masas de cuadrupolo
tiempo
masa
Potencial de radiofrecuencia
Potencial corriente directa
Relación de voltajes durante un barrido de masa con
un analizador cuadrupolo
EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight)
pulsos de 300 V, 3.000-20.000 veces/s
Se aplica una ΔV a las rejillas aceleradoras de 300 V (3000
a 20.000 veces por segundo) para acelerar los iones y
lanzarlos a un tubo de deriva con una energía cinética
constante. Los iones, con igual energía cinética pero distinta
relación masa/carga, adquieren distinta velocidad.
EM de tiempo de vuelo (TOF: time of flight)
pulsos de 300 V, 3.000-20.000 veces/s
Ecinética = ½ mv2
El orden de llegada al detector es: desde los más livianos a los
más pesados. En el EM se representa la corriente del detector
en función del tiempo.
Espectrómetro de masas de trampa iónica (ITD)
electrodo
anular central
Vrf
tapa
tapa
Consiste en un electrodo anular y un par de electrodos
colectores. Cuando las moléculas llegan a la trampa, se
ionizan y fragmentan. Los iones permanecen en la trampa
iónica con trayectorias estables. Al electrodo anular se aplica
un potencial de radiofrecuencia variable que controla el
barrido.
Espectrómetro de masas de trampa iónica (ITD)
electrodo
anular central
Vrf
tapa
tapa
El análisis de los iones se logra con pulsos sucesivos de
radiofrecuencia (rf) creciente: las trayectorias se vuelven
inestables y los iones son expulsados sucesivamente por
la trampa hacia el multiplicador de electrones donde se
detectan. Los iones se retienen o expulsan de la trampa en
función de su relación m/z.
Espectros de masas
Dependen de:
Energía de ionización de la molécula
Grupos funcionales de la molécula
Método de ionización
Presión y temperatura de trabajo
Diseño instrumental
Espectros de masas obtenidos por impacto electrónico
Etilbenceno
pico base
En este ejemplo el pico
base se forma por pérdida
de CH3
ion molecular (ion “parent”)
→ fragmento de
mayor masa
M+
Átomos y grupos
frecuentemente
desplazados
molécula con número par de N → M+ con masa par
molécula con número impar de N→ M+ con masa impar
4 H → M-4
CH3→ M-15
NH3 → M-17
H2O → M-18
F → M-19
HF → M-20
C2H2 → M-26
Espectros de masas de cloruro de metileno
Impacto electrónico
pico base → pérdida de Cl
Picos isotópicos
12C1H 35Cl
(m= 84)
2
2
13C1H 35Cl
2
2
(m= 85)
12C1H 35Cl37Cl
2
(m= 86)
13C1H 35Cl37Cl
2
(m= 87)
12C1H 37Cl
2
2
(m= 88)
Espectros de masas de pentobarbital (sedante)
Impacto electrónico
Ionización química
El ion molecular (m/z = 226) prácticamente no se distingue
Espectros de masas de 1-decanol (PM = 158)
Impacto electrónico
Ionización química
Cromatografía Gaseosa – EM
Sistemas de acople
Separador de chorro (columnas rellenas)
Ensamblaje con columnas capilares
cámara de
evacuación
hacia la
bomba
A cámara
de
ionización
desde el
CG
constricción
de entrada
tubo de vidrio
poroso
constricción
de salida
collarín que se atornilla
en el receptáculo de
fuente iónica
Cromatografía Líquida – EM
Sistema de acople
Formación de iones gaseosos a partir de analitos en solución
Consideraciones en la conexión LC/MS
Ionización a presión atmosférica (API)
Es una familia de técnicas que incluye
 Electronebulización asistida con un gas:
electrospray (ESI)
 Ionización química a presión atmosférica (APCI)
 Fotoionización a presión atmosférica (APPI)
Electronebulización asistida con
un gas
Electrospray (ESI)
(ortogonal)
Iones desolvatados
HPLC
Malla de montaje: -3500 V
(atraerá cargas + a la
superficie de la gota)
La fase móvil con el analito se nebulizan a un elevado
voltaje asistidos con una corriente coaxial de N2
generando un fino aerosol, con formación de
microgotas altamente cargadas (la solución ya
contiene iones )
(ortogonal)
Iones desolvatados
HPLC
Malla de montaje: -3500 V
(atraerá cargas + a la
superficie de la gota)
A medida que el solvente se evapora, la densidad de carga en
las gotas aumenta y al llegar al límite Rayleigh la gota sufre
explosiones de Coulomb y se rompe en gotas más pequeñas.
Los iones libres de solvente (desolvatados) se mueven hacia el
analizador de masa. En el caso mostrado, la diferencia de
potencial negativa hace que los cationes entren al capilar
La solución se
inyecta
directamente en
el instrumento
La caída de
voltaje entre la
fuente y el
analizador
genera gotas
ionizadas
El solvente se
evapora a medida
que las gotas hacen
su recorrido
presión atmosférica
vacío
Expulsión de gotas cargadas
Agua
Metanol
Cloroformo
Acetonitrilo
Las gotas grandes
espontáneamente se
rompen en gotas
menores debido a
repulsión electrostática
La solución inyectada
usualmente incluye agentes
ionizantes: H+, Na+, K+
Gas y/o calor
disminuyen el
tamaño de las gotas
Los iones resultantes
pueden ser sencillos
o con carga múltiple
Iones observados frecuentemente
¿Cuándo es apropiado trabajar en ESI?
- Solutos
ionizables de alto y bajo peso molecular. El analito
de interés debe ser capaz de portar carga en solución
Ejemplos:
a) Muestras con heteroátomos: carbamatos, benzodiacepinas
b) Ácidos y bases
c) Especies iónicas: fosfatos, conjugados con grupos sulfato,
aminas, etc
d) Muestras que se multi-cargan en solución (ej: péptidos,
proteínas, oligonucleótidos)
e) Compuestos que pueden aceptar carga inducida
Evitar: muestras con grupos no polares (ej. HPAs)
Ionización química a presión atmosférica
APCI
La fase móvil y el
analito se
nebulizan
(dispersan en
pequeñas gotas)
y vaporizan a
elevada
temperatura, y
entran en la
región corona
(entre la aguja y
el capilar).
Las moléculas de
fase móvil se
ionizan en la
región corona por
electrones
provenientes de
una descarga
eléctrica,
transformándose
en iones gaseosos
reactivos
Estos iones
reactivos (iones
formados de la
fase móvil)
reaccionan con
las moléculas
de analito,
ionizándolas
Ionización APCI clásica
Reacciones de ionización positiva
Reactivo/reacción electrón
solvente –
e-
fase gas
[solvente+H]+
Transferencia protónica
[solvente+H]+
+ analito
fase gas
[analito+H]+ + solvente
Ionización APCI clásica
Reacciones de ionización negativa
Captura electrónica
e- + solvente
fase gas
[solvente]-
Intercambio de cargas
[solvente]-
+ analito
fase gas
[analito]- + solvente
Reacciones ion molécula
analito + [solvente]- fase gas [analito-H]- + [solvente+H]
¿Cuándo es apropiado trabajar en APCI?
Muestras: Compuestos de PM/polaridad intermedias (bifenilos
policlorados (PCBs), ácidos grasos, ftalatos, etc).
Compuestos sin grupos ácidos/básicos (ej: hidrocarburos,
alcoholes, aldehidos, cetonas y esteres)
Muestras
con
heteroátomos
(ureas,
benzodiacepinas,
carbamatos, etc). Analitos con mal comportamiento ESI
Parámetros en solución: Mucho menos sensible a las
condiciones de disolución que ESI. Tolera mayores flujos.
Admite solventes no compatibles con ESI
Evitar: muestras térmicamente lábiles, o cargadas en solución,
o biomoléculas (habitualmente no volátiles).
Principales características de ESI y APCI
Estas interfaces son hoy en día las más utilizadas
Fotoionización a presión atmosférica
APPI
APPI (modo positivo)
El solvente y la
muestra se nebulizan
y son completamente
vaporizados por
calefacción.
La ionización del
solvente y la muestra
ocurre por bombardeo
con fotones a partir de
una lámpara UV
La molécula de analito M se ioniza a ion molecular
(si el potencial de ionización del analito es menor a
la energía del fotón).
El ion M.+ puede extraer un hidrógeno del solvente
para formar [M+H]+
Un dopante fotoionizable está en exceso y rinde
muchos iones moleculares.
El analito se ioniza por transferencia protónica a
partir del dopante o solvente
El ión molecular del dopante ioniza al analito
por transferencia electrónica
¿Cuándo usar APPI?
• Puede ionizar compuestos que no se ionizan bien con ESI
o APCI (ej: PAHs).
• Tiene mejor sensibilidad global para algunos compuestos
(THC-tetrahidrocanabinol, ácido benzoico, vitaminas no
hidrosolubles).
• Tiene mejor sensibilidad a bajas velocidades de flujo que
APCI.
• Es robusto y altamente reproducible.
Selección del sistema CL/EM
Peso molecular
100.000
ESI
10.000
APPI
1.000
APCI
GC/MS
No polar
Muy polar
Polaridad del analito
Registros gráficos CG-EM y CL-EM
Modos de adquisición de la señal
 Cromatograma de corriente iónica total
 Cromatograma de ión seleccionado
 Arreglo tridimensional: señal en función del tiempo
(información cromatográfica) y en función de la
relación m/z (información espectroscópica)
Registros gráficos CG-EM y CL-EM
Modos de adquisición de la señal
Modo scan
Consiste en hacer barridos entre dos valores de masas para
tener la información total de la muestra. Se emplea en análisis
cualitativo para la identificación de compuestos por búsqueda
en biblioteca de espectros. También se usa para cuantificar.
Registros gráficos CG-EM y CL-EM
Modos de adquisición de la señal
Modo scan
Se puede trabajar con:
TIC (total ion chromatogram)
Sensibilidad
cromatograma correspondiente a la suma de
media
abundancias a todas las masas adquiridas.
EIC (extracted ion chromatogram)
cromatograma correspondiente a una
determinada masa (extraída del barrido)
Alta
sensibilidad y
selectividad
Registros gráficos CG-EM y CL-EM
Modos de adquisición de la señal
Modo SIM
Consiste en una monitorización selectiva de iones
característicos de la muestra. Ideal para cuantificar vestigios
de compuestos conocidos. En este modo, el detector es muy
sensible y muy selectivo.
Registros gráficos CG-EM y CL-EM
Modos de adquisición de la señal
Modo SIM
La comparación de las respuestas relativas de los distintos
iones con respecto a las del patrón permite confirmar la
identificación del compuesto analizado.
La sensibilidad aumenta con la disminución del número de
masas seleccionado.
Modos de adquisición en GC/MS
SCAN vs SIM
Síntesis de 1Br-butano a partir de butanol (CG-EM)
CH3(CH2)3OH + Br-
CH3(CH2)3Br + OH-
1-butanol
1-bromobutano
cromatograma
EM pico 1
EM pico 2
Combustión de tela tratada con producto
ignífugo
Cromatograma de
corriente iónica
total (TIC)
EM de pico 12
(benceno)
Confirmación presencia de cocaína en orina
por CG-masa
Cromatograma de corriente iónica total
EM de testigo de cocaína (m = 303)
a igual tiempo de elución
EM del pico a 11.5 min
Mezcla de 6 herbicidas resuelta por HPLCmasas
Cromatograma
convencional
con detección
UV
Cromatograma de masas de corriente iónica total
Detección de
un ion
seleccionado
m/z = 312
(corresponde a
MH+ formado a
partir de
imazaquina de
masa = 311)
Representación de la estructura
tridimensional de datos CG-EM en modo
barrido completo (full-scan)
Se obtiene: el cromatograma iónico total, el cromatograma
iónico de un ión seleccionado (a determinada masa) y los
espectros de masas (a determinados tiempos de retención)