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IMPLEMENTACIÓN DE TÉCNICAS
RÁPIDAS PARA LA DETERMINACIÓN
DE Legionella.
Inma Solís
I Congreso Internacional de detección rápida de Legionella. Castellón 2015
www.iproma.com
IPROMA ofrece un servicio integral, adaptado a sus
necesidades, que incluye desde la toma de muestras,
logística con envío o recogida de envases o material de
muestreo, envío automático de alertas o de informes de
ensayo en PDF, etc.
A través de nuestra web se puede conocer la situación
de las muestras en todo momento, descargarse los
resultados en diversos formatos, consultar el histórico
de las muestras, etc.
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PROYECTOS I+D+i
STO3RE; Validación de un nuevo concepto de EDAR autosuficiente como centro
mancomunado de gestión de lodos con recuperación de nutrientes de origen
agropecuario.
REMEB: implementación y validación de bioreactor cerámico MBR de bajo coste en
una planta EDAR de origen agrícola e industrial.
MICROFILCER; Desarrollo de filtros cerámicos autolimpiables mediante microondas
y aplicación a la filtración de muestras medioambientales.
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Índice
Necesidad.
Métodos alternativos
Validación
Conclusiones
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NECESIDAD: satisfacción cliente
Rapidez: agilidad en la toma de decisiones
Fiabilidad: técnica sensible, buena recuperación, informe de validación
Bajo coste: reactivo + tiempo de ensayo + equipamiento + entrenamiento
Acreditable: según ISO 17025 por ENAC
Adecuado al fin previsto
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NECESIDAD: fin previsto
Objetivo de la
técnica
Target de la
determinación
Estrategia de
detección
Fin previsto
Aislamiento de la
bacteria
Célula
Aislar y CRECER la
bacteria en cultivo
Cumplimiento
legislativo
cultivable
Identificación de la
bacteria aislada
Ácidos nucleicos libres
o extraídos en células
viables y no viables
Extraer y AMPLIFICAR
una secuencia génica
Epidemiológico:
Confirmar la sospecha
Detección rápida del
nivel en la muestra
ambiental
Célula intacta libre
(potencialmente
infectiva)
Concentrar y
CAPTURAR la célula
libre
Preventivo: evitar el
nivel infectivo
(contención primaria)
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MÉTODOS ALTERNATIVOS
PCR
PMA – PCR
FISH
IMS: LEGIPID
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PCR
ISO 12869
Interferencias de matriz
Límite bajo (UE)
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PMA - PCR
Posible citotoxicidad
Variabilidad entre
réplicas
Límite medio (UE)
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FISH
Límite alto
Difícil obtener recuentos
Identificación específica
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Legionella spp. (Manz et al. 1995):
LEG705: CTG GTG TTC CTT CCG ATC
FISH
Legionella pneumophila (Grimm et al. 1998):
LEGPNE1: ATC TGA CCG TCC CAG GTT
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IMS: LEGIPID
103
102
104
102
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LEGIPID
Certificado AOAC nº 111101
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LEGIPID
Certificado AOAC nº 111101
Validación inicial: 2 laboratorios ISO 17025
Sensibilidad
95,3 %
Especificidad
88,4 %
Falsos positivos
11,6 %
Falsos negativos
4,7 %
Eficiencia
92,4 %
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LEGIPID
Certificado AOAC nº 111101
Validación inicial: 2 laboratorios ISO 17025
Estudio intercolaborativo 12 laboratorios
2 blancos
100 % concordancia
2 muestras valor
asignado 2,88 log
3 muestras valor
asignado 3,82 log
2 muestras valor
asignado 2,23 log
95,8 % concordancia
91,7 % concordancia
91,7 % concordancia
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LEGIPID
Certificado AOAC nº 111101
Validación inicial: 2 laboratorios ISO 17025
Estudio intercolaborativo 12 laboratorios
Estudio inclusividad / exclusividad
64 cepas colección y
ambientales Legionella NO
pneumophila
58 cepas detectadas
(91 % )
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LEGIPID
Certificado AOAC nº 111101
Validación inicial: 2 laboratorios ISO 17025
Estudio intercolaborativo 12 laboratorios
Estudio inclusividad / exclusividad
Recuperación con muestras reales (sin inocular)
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Ɩ Legipid-Cultivo Ɩ, log CFU
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Natural
M1
M2
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Cuantitativo
Cualitativo
Recuperación
Reproducibilidad
Límite de detección
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PARÁMETROS
CULTIVO EN PLACA
ISO 11731
TÉCNICAS
MOLECULARES
(PCR y PMA-PCR)
TÉCNICA
FISH
LEGIPID
TIEMPO de
RESULTADO
10-15 DÍAS
3-6 HORAS
4-6 HORAS
60 MINUTOS
CUALIFICACIÓN
DEL OPERARIO
MEDIA
ALTA
ALTA
BAJA
ESPECIFICIDAD
MEDIA
ALTA
ALTA
MEDIA / ALTA
AUTOMATIZACIÓN
NO
SI
NO
SI
INSTRUMENTAL
ESPECÍFICO
NO
SÍ
SI
NO
TRAINING
MEDIO
ALTO
MEDIO / ALTO
BAJO
LOD
BAJO / MEDIO
(teórico / real)
BAJO (PCR)
MEDIO (PMA-PCR)
MEDIO / ALTO
(células)
(UFC equivalentes)
SI
SI (PCR)
Difícil (PMA-PCR)
Difícil
SI
ACREDITABLE
MEDIO – BAJO
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PARÁMETROS
CULTIVO EN PLACA
ISO 11731
TÉCNICAS
MOLECULARES
(PCR y PMA-PCR)
TÉCNICA
FISH
LEGIPID
TIEMPO de
RESULTADO
10-15 DÍAS
3-6 HORAS
4-6 HORAS
60 MINUTOS
CUALIFICACIÓN
DEL OPERARIO
ESPECIFICIDAD
AUTOMATIZACIÓN
MEDIA
ALTA según volumenALTA
Limite de detección es teórico
sembrado de muestra.
MEDIA
ALTA
ALTA
El límite de detección real no proporciona
NO
SI
NO
cumplimiento
al RD 865/2003.
BAJA
ALTA
SI
INSTRUMENTAL
ESPECÍFICO
NO
SÍ
SI
NO
TRAINING
MEDIO
ALTO
MEDIO / ALTO
BAJO
LOD
BAJO / MEDIO
(teórico / real)
BAJO (PCR)
MEDIO (PMA-PCR)
MEDIO / ALTO
(células)
(UFC equivalentes)
SI
SI (PCR)
Difícil (PMA-PCR)
Difícil
SI
ACREDITABLE
MEDIO – BAJO
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PARÁMETROS
CULTIVO EN PLACA
ISO 11731
TÉCNICAS
MOLECULARES
(PCR y PMA-PCR)
TÉCNICA
FISH
LEGIPID
TIEMPO de
RESULTADO
10-15 DÍAS
3-6 HORAS
4-6 HORAS
60 MINUTOS
CUALIFICACIÓN
DEL OPERARIO
ESPECIFICIDAD
AUTOMATIZACIÓN
MEDIA
ALTA según volumenALTA
Limite de detección es teórico
sembrado de muestra.
MEDIA
ALTA
ALTA
El límite de detección real no proporciona
NO
SI
NO
cumplimiento
al RD 865/2003.
BAJA
ALTA
SI
INSTRUMENTAL
ESPECÍFICO
NO
SÍ
SI
NO
TRAINING
MEDIO
ALTO
MEDIO / ALTO
BAJO
LOD
BAJO / MEDIO
(teórico / real)
BAJO (PCR)
MEDIO (PMA-PCR)
MEDIO / ALTO
(células)
(UFC equivalentes)
SI
SI (PCR)
Difícil (PMA-PCR)
Difícil
SI
ACREDITABLE
MEDIO – BAJO
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PARÁMETROS
TIEMPO de
RESULTADO
CULTIVO EN PLACA
ISO 11731
TÉCNICAS
TÉCNICA
MOLECULARES
FISH
(PCR y PMA-PCR)
ISO 8199:2005. Los recuentos en placa por debajo de 4
10-15
DÍAS
HORAS
son estimados
y para 3-6
4 la HORAS
precisión relativa 4-6
es del
50%.
LEGIPID
60 MINUTOS
CUALIFICACIÓN
DEL OPERARIO
MEDIA
ALTA
ALTA
BAJA
ESPECIFICIDAD
MEDIA
ALTA
ALTA
ALTA
AUTOMATIZACIÓN
NO
SI
NO
SI
INSTRUMENTAL
ESPECÍFICO
NO
SÍ
SI
NO
TRAINING
MEDIO
ALTO
MEDIO / ALTO
BAJO
LOD
BAJO / MEDIO
(teórico / real)
BAJO (PCR)
MEDIO (PMA-PCR)
MEDIO / ALTO
(células)
(UFC equivalentes)
SI
SI (PCR)
Difícil (PMA-PCR)
Difícil
SI
ACREDITABLE
MEDIO – BAJO
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Gracias
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Castellón
Cataluña
Madrid
Andalucía
Aragón
Galicia
Valencia
964 25 10 72
938 67 54 15
916 58 74 40
955 67 70 33
976 52 24 90
986 23 92 02
963 89 12 66