1. Ciencia

Título del proyecto: Formulación de una vacuna experimental contra Dermatobia hominis (Diptera:
Cuterebridae) en Panamá.
Autor de la ponencia: Gilberto A. Eskildsen Tuñón
Programa: Maestría en Biotecnología. Vicerrectoría de Investigación y Post Grado de la Universidad de
Panamá.
Equipo investigador:
Profesor: Argentina Ying B. Universidad de Panamá. [email protected]
Estudiante: Gilberto Eskildsen: Universidad de Panamá. [email protected]
Gloria González: Instituto de Biotecnología de la Universidad de Granada e Instituto Conmemorativo
Gorgas de Estudios de la Salud. [email protected]
Co-Asesor: Antonio Osuna: Instituto de Biotecnología de la Universidad de Granada. [email protected]
Área de discusión: Ciencias de la salud: “Biotecnología aplicada al desarrollo de vacunas y control de
parásitos”
Resumen
La búsqueda de dianas con potencial antigénico presente en los estadios larvales de Dermatobia hominis y
su evaluación mediante la aplicación de una vacuna experimental contra la miasis ha sido ensayada
experimentalmente en ganado bovino. Fue utilizada una muestra de siete terneros de once meses de
edad, sin exposición previa a la infestación por D. hominis. Como antígeno para llevar a cabo las
inmunizaciones se usó un péptido sintético de 13 amino ácidos denominado ArKDh1, perteneciente a la
región catalítica de la enzima arginina quinasa (gi|328679756), junto al adyuvante lipídico Montanide
ISA50V2.
Del análisis estadístico de los resultados obtenidos se deduce que hay diferencias significativas (p<0,0001)
cuando se comparó el numero de nódulos y el titulo de anticuerpos de los animales pertenecientes al
grupo inmunizado frente a los dos grupos controles no inmunizados con el péptido sintético y el
adyuvante. El ganado inmunizado con la mezcla ArKDh1/adyuvante montanide ISA50V2, presento
elevación de los títulos de anticuerpos desde el día 15 de la inmunización manteniéndose en todos los
casos superiores al valor de corte. La protección obtenida del experimento fue del 86%, los resultados
mostraron que la vacunación con el péptido ArKDh1 puede constituir un método útil de inmunización,
levantado una respuesta inmune protectora mediada por anticuerpos contra la miasis causada por D.
hominis. Estos resultados podrían constituir una nueva estrategia de control de las miasis con la ventaja
potencial de reducir el uso de agentes químicos que constituyen un problema de seguridad alimentaria,
inducción de resistencia a insecticidas.
Summary
The search for potential antigenic targets with this in the larval stages of Dermatobia hominis and
evaluation by applying an experimental vaccine has been experimentally tested myiasis in cattle. It was
used a sample of seven calves eleven months old, with no previous exposure to infestation by D. hominis,
By the oil adjuvant Montanide ISA50V2 | as antigen to perform immunizations a synthetic peptide of 13
amino acids called ArKDh1 belonging to the catalytic region of the enzyme arginine kinase (gi 328679756)
was used.
Statistical analysis of the results shows that there are significant differences (p <0.0001) when the number
of nodes and the antibody titer of the animals belonging to the group immunized against the two control
groups immunized with the peptide not compared synthetic and adjuvant. Cattle immunized with ArKDh1
/ adjuvant mixture montanide ISA50V2, presented elevated antibody titers from day 15 of immunization in
all remaining above the cutoff value cases. The protection obtained from the experiment was 86%, results
showed that vaccination with ArKDh1 peptide may be a useful method of immunization, raised a
protective immune response mediated by antibodies against myiasis caused by D. hominis. These results
could provide a new strategy for control of myiasis with the potential advantage of reducing the use of
chemical agents that constitute a food safety problem, induction of resistance to insecticides.
TEXTO DE LA PONENCIA
Formulación de una vacuna experimental contra Dermatobia hominis (Diptera:Cuterebridae)
en Panamá.
Introducción
Dermatobia hominis (Linnaeus, Jr.), es una mosca biontófaga causante de miasis obligatoria, cuya
distribución geográfica abarca zonas cálidas y húmedas de América. La miasis foruncular causada por la
larva de la D. hominis se le conoce con diferentes nombres en América latina (ura, berne, nuche,
colmoyote) en Panamá se le conoce con el nombre de tórsalo.
La hembra adulta de D. hominis no se alimenta e incluso y pega sus huevos usualmente en el abdomen de
insectos hematófagos a los que previamente captura [1]. El insecto, que sirve de transportador forético, al
sentirse atraído por el hospedador, pone en contacto las larvas de primer estadio (L1) en la piel del
hospedador en las proximidades del lugar donde se posó. Las larvas L1 penetran y permanece en la piel
de uno a dos meses, hasta convertirse en larvas de tercer estadio (L3). Las L3 dejan el hospedador, caen al
suelo para allí, pupar y sufrir la ecdisis que dará lugar a las moscas adultas y así continuar el ciclo [2].
Prácticamente todos los mamíferos, incluido el hombre, son susceptibles de actuar como hospedadores de
las larvas parásitas, desarrollando en la piel y tejido subcutáneo lesiones furunculares con las larvas en
desarrollo.
El impacto económico de la miasis causada por D. hominis en América Central no está bien documentado;
sin embargo, tan solo en Brasil se calculan pérdidas por el orden de los US$ 250 millones por año [3]. Se
estima que, dependiendo del número de nódulos formados por las larvas (20 a 40 nódulos), se puede
producir una merma de hasta 12% del peso vivo del animal y en vacas lecheras una disminución de un 20%
de la producción láctea, además del consiguiente daño en las pieles, que resultan inutilizados para la
elaboración del cuero. Tan solo en Panamá, el costo que genera el control del tórsalo se estima en unos
US$ 13 400 534 [4], considerándose la mayor causa de pérdidas de la producción ganadera. Los casos en
humanos que se han descrito, se han asociado generalmente al ambiente silvestre, turistas, excursionistas
y en personas que hacen turismo ecológico [5] [6-14].
El impacto del tórsalo en humanos ha sido subestimado por el sector salud, sin embargo, este problema
será cada vez más valorado y se dimensionará mejor su impacto negativo [15]. Muchas de las denuncias
de nuevos casos provienen de países donde no son endémicos y que ciudadanos de esos países lo
contrajeron en vistas turísticas o vacacionales a los países endémicos.
En la actualidad el control de la miasis se lleva a cabo mediante el uso de compuestos químicos
especialmente ivermectina, los cuales constituyen un riesgo al pasar sus residuos a la cadena alimenticia a
través de las carnes, leches y sus derivados [16]. La Agencia Europea de Medicamentos ha establecido los
límites máximos de residuos de ivermectina, con el fin de garantizar que la concentración que se pueda
encontrar en los productos alimenticios animales esté por debajo de niveles peligrosos para los
consumidores [17].
Existen pocos trabajos en vacunas para el control de miasis, estos se han enfocado en el estudio de
proteasas de excreción/secreción, relacionadas con el proceso de penetración de la larva [18]. Se han
encontrado proteasas en las larvas de otros dípteros, estudiándose el posible potencial antigénico y papel
inmunomodulador en la inmunidad adquirida para el desarrollo de vacunas, con especial atención en
especies como Lucilia cuprina [19], Hypoderma lineatum [20, 21], Chrysomyia bezziana [22] y Oestrus ovis
[23, 24]. Un estudio realizado en Brasil describió la secuencia de una proteína de 50 kDa (Dh50),
posiblemente específica para D. hominis, con potencial antigénico [25]. El presente estudio busca nuevas y
mejores alternativas para el control de la miasis causada por D. hominis, que conlleven menos riesgo a la
salud alimentaria, evitar futura resistencia a insecticidas, reducir los casos en humanos, y mejorar el
saneamiento ambiental.
Problema u objeto de investigación
Considerando el impacto económico en la ganadería para el control de esta miasis, las implicaciones
ambientales del control actual basado en el uso de insecticidas, el problema sanitario por la residuos de
insecticidas en los productos cárnicos y la leche, se propuso este estudio con el objetivo buscar nuevas
estrategias de control a través de la formulación de una vacuna experimental para el control del tórsalo
que permita disminuir la afección del cuero causada por Dermatobia hominis; reducir la incidencia de
tórsalo en la ganadería panameña y centroamericana, mejorar la producción de ganado lechero y de
carne, y prevenir las afecciones humanas causadas por esta miasis.
Metodología empleada.
Realizamos 11 giras de colectas a fincas identificadas y georeferencidas con animales infestados, para
colectar diversos estadios de Dermatobia hominis que sirvieran como fuente de antígenos y obtener
sueros de bovinos infestados y sanos. De este material se hizo la extracción de ADN y ARN total y ARNm,
preparamos y recopilamos antígenos nativos, los cuales fueron analizados a través de electroforesis de
proteínas, western blot, finger printing por espectrofotometría de masas, análisis bioinformático de los
resultados del MASCOT, la síntesis de un péptido y dot blot. Las proteínas identificadas fueron ordenadas
de acuerdo a los siguientes criterios: número de banda, nombre, código de acceso proteína, masa,
secuencias peptídicas, número de aminoácidos, porcentaje de cobertura y familia. Las huellas peptídicas
obtenidas del estudio por MALDI-TOF se analizaron utilizando las principales bases de datos: National
Center for Biotechnology Information (NCBI), Database of Drosophila Genes & Genomes (FlyBase).
Utilizamos la aplicación ANTIGENIC del software European Molecular Biology Open Software Suite
(EMBOSS®) para predecir sitios potencialmente antigénicos. Una vez se identificaron las secuencias
peptídicas de interés (péptido antigénico) se sintetizó el péptido (Gen Script, pureza del 96%) el cual fue
posteriormente utilizado en las pruebas de dot blot e inmunizaciones experimentales.
Protocolo de inmunización
Para el protocolo de inmunización experimental, utilizamos una muestra de siete terneros, sin previa
exposición a la infestación por D. hominis usando el péptido de 13 amino ácidos denominado ArKDh1,
perteneciente a la región catalítica de la enzima arginina quinasa, el mismo se mezcló en una emulsión con
el adyuvante montanide ISA50V2 Los títulos de anticuerpos se monitorearon con la técnica de ELISA,
paralelamente a la búsqueda de lesiones furunculares con presencia del parásito en el ganado.
Análisis estadístico
Se analizaron los datos (títulos de anticuerpos y número de nódulos) mediante el análisis de mediciones
repetidas de ANOVA. La prueba de Bonferroni se utilizó para determinar la diferencia entre cada grupo.
Una p ≤ 0.01 fue considerada como significativa. El software GraphPad Prism 6.0 fue usado para realizar el
análisis estadístico.
Resultados
Una diferencia significativa (p<0,0001) se obtuvo al comparar el grupo inmunizado con los dos grupos
controles no inmunizados con ArKDh1. El ganado inmunizado con la mezcla ArKDh1/adyuvante montanide
ISA50V2, presentó una elevación de los títulos de anticuerpos y un porcentaje de protección de 86%
contra el parásito
Discusión
En nuestros resultados se obtuvo una diferencia significativa (p ≤ 0.0001) en los títulos de anticuerpos de
los animales del grupo A inmunizado con el péptido sinteticoArKDh1, versus los títulos calculados en el
grupo control B y grupo C que no presentaron elevación en el título de anticuerpos. Al comparar los títulos
de anticuerpos entre el grupo B y C no existe diferencia significativa ya que en ambos esta ausente el
péptido ArKDh1 (p = 0.999). Esto sugiere que la capacidad de elevación de los títulos de anticuerpos está
atribuida, específicamente, al péptido ArKDh1 y no a los otros componentes presentes en la emulsión.
A pesar de contar con una muestra de siete individuos, encontramos importantes diferencias entre los
grupos, por lo tanto, este estudio puede ameritar el desarrollo de un segundo protocolo de inmunización
con una muestra más robusta y añadiendo otros análisis, como el tiempo de protección de la vacuna y el
número de dosis necesarias para obtener un efecto óptimo.
La eficacia de la vacunación se determinó por la presencia o cantidad (nódulos) de larvas del ectoparásito
en el grupo A en comparación a los grupos B y C. Para el grupo A se obtuvo un porcentaje de protección
del 86% en comparación con el grupo B y el grupo C. Al comparar los resultados del número de nódulos
presente en el grupo A con B y C, se obtuvo una diferencia significativa (p ≤ 0.0001). Esto sugiere que el
péptido sintético ArKDh1 no sólo es capaz de levantar el título de anticuerpos, sino que estos anticuerpos
presentes en el suero de los animales inmunizados del grupo A (12 nódulos a los 150 días post-reto)
proporcionan una fuerte respuesta inmune tipo humoral, lo suficiente para evitar la infestación por larvas
de D. hominis.
Potencialmente, estos resultados pueden contribuir indirectamente a disminuir los casos de tórsalo en
humanos, situación que es más común en países de Centro y Sur América. Debido al aumento del turismo
ecológico y al consecuente aumento de los viajes generalizados, esta miasis foruncular, también, se ha
vuelto cada vez más frecuente en personas de América del Norte y Europa.
Estos resultados revelan una nueva alternativa de utilizar la inmunización contra parásitos causantes de
miasis como una estrategia de control, por medio de la inducción inmunidad protectora determinada por
una respuesta humoral de anticuerpos. Finalmente, nuestros resultados, potencialmente, permitirían
reducir los costos actuales en el control del tórsalo, disminuir la resistencia a insecticidas y evitar los
riesgos en la salud alimentaria por el uso no controlado de químicos.
Referencias
1. Mourier, H., Banegas, A.D., 1970. Observations on the oviposition and the ecology of the eggs
of Dermatobia hominis (Diptera: Cuterebridae). Videnskabelige Meddelelser fra Dansk
Naturhistorik Forening 133, 59-68.
2. Ardila, C. 2006. Thesis. Comparación de los Tratamientos para el Control de “Dermatobia
hominis” en la Finca de la Cañada en el Municipio de Teruel Huila. Fundación Instituto
Colombiano de Homeopatía “Luis G. Páez” Departamento de Medicina Veterinaria. Bogotá
Colombia.
3. Grisi, L., et al, 2002. Impacto econômico das principais ectoparasitoses em bovinos no Brasil. A
Hora Veterinária 21, 8-10.
4. Barsallo A., González A., León C., Vásquez E., Moreno H., Mendieta R., 2005. Thesis: Impacto
Económico y Social del Tórsalo. Facultad de Economía. Universidad de Panamá. Panamá
5. Molano, F. y Ying, A., 2005. Thesis. Ecoepidemiología de las miasis humanas en Panamá.
Programa Centroamericano de Maestría en Entomología. Universidad de Panamá. Panamá
6. Acha P, Szyfres B. 1994. Zoonoses and communicable disease common to man and animals.
2nd Edition. Scientific Publication No. 503. Pan American Health Organization. WHO,
Washington, D.C. 963 pp.
7. Haruki, K., Hayashi, T., Kobayashi, M., Katagiri, T., Sakurai, Y., Kitajima, T., 2005. Myiasis with
Dermatobia hominis in a Traveler Returning from Costa Rica: Review of 33 Cases Imported
from South America to Japan. Journal of Travel Medicine 12, 285-288.
8. Lawson RD, Rizzo M. 2005. Digital infestation with the human bot fly. Journal of Hand Surgery
30B: 490-491.
9. Lang T, Smith DS. 2003. Wiggling subcutaneous lumps. Clinical Infectious Diseases 37: 20872088.
10. Liebert PS, Madden RC. 2004. Human botfly larva in a child's scalp. Journal of Pediatric Surgery
39: 629-630.
11. Maier H, Honigsmann H. 2004. Furuncular myiasis caused by Dermatobia hominis, the human
bot fly. Journal of the American Academy of Dermatology 50: S26-S30.
12. Marty FM, Whiteside KR. 2005. Myiasis due to Dermatobia hominis (Human Botfly). New
England Journal of Medicine 23: 352.
13. Millikan LE. 1999. Myiasis. Clinical Dermatology 17: 191-195
14. Sampson C E, MaGuire J, Eriksson E. 2001. Botfly myiasis: case report and brief review. Annals
of Plastic Surgery 46: 150-152.
15. Pérez, E., 2002. Valoración económica y social del efecto del tórsalo en América Central. In:
(IICA), I.I.d.C.p.l.A. (Ed). Mimeo.
16. Moriena, R., Racioppi, O., Álvarez, J., 2009. Efecto curativo y preventivo de una Ivermectina
Larga Acción contra la URA (Dermatobia hominis) en bovinos naturalmente infestados, en la
provincia de Corrientes: Argentina. Universidad Nacional del Nordeste.
17. Oficina de Publicaciones Oficiales de las Comunidades Europeas (OPCE), 2003. Texto
consolidado. Sistema CONSLEG, 1990R2377-ES-16.08.2003-043.001, 1-116.
18. Oliveira-Sequeira, T.C., Sequeira, J.L., Schmitt, F.L., DE Lello, E., 1996. Histological and
immunological reaction of cattle skin to first-instar larvae of Dermatobia hominis. Med Vet
Entomol 10, 323-330.
19. Sandeman et al., 1990. Trypticand chymotryptic proteases relased by larvae of the blowfly,
Lucilia cuprina. Int. J. Parasitol. 20, 1019–1023.
20. Moire, N., 1998. Hypodermin A and Inhibition of Lymphocyte Proliferation. Parasitology Today
14, 455-457.
21. Otranto, D., 2001. The immunology of myiasis: parasite survival and host defense strategies.
Trends in Parasitology 17, 176-182.
22. Muharsini, S., Sukarsih, Riding, G., Partoutomo, S., Hamilton, S., Willadsen, P., Wijffels, G.,
2000. Identification and characterisation of the excreted/secreted serine proteases of larvae
of the Old World Screwworm Fly, Chrysomya bezziana. International Journal for Parasitology
30, 705-714.
23. Angulo-Valadez, C.E., Cepeda-Palacios, R., Jacquiet, P., Dorchies, P., Prévot, F., Ascencio-Valle,
F., Ramírez-Orduña, J.M., Torres, F., 2007. Effects of immunization of Pelibuey lambs with
Oestrus ovis digestive tract protein extracts on larval establishment and development.
Veterinary Parasitology 143, 140-146.
24. Tabouret, G., Bret-Bennis, L., Dorchies, P., Jacquiet, P., 2003. Serine protease activity in
excretory-secretory products of Oestrus ovis (Diptera: Oestridae) larvae. Veterinary
Parasitology 114, 305-314.
25. Fernandes, N.M., Zanata, S., Ronnau, M., Soccol, C., Pandey, A., Thomaz-Soccol, V., 2012.
Production of Potential Vaccine Against Dermatobia hominis for Cattle. Applied Biochemistry
and Biotechnology 167, 412-424.