Manual de usuario

®
TaqMan GMO
Screening Kit
Part No: 4466334
1. Introducción
Los organismos modificados genéticamente (OMG) se encuentran ampliamente
distribuidos, siendo la soja y el maíz los vegetales que ocupan mayor extensión
de cultivo a nivel mundial. Estas especies y sus derivados (almidón de maíz,
proteína de soja, etc.) constituyen los ingredientes de más del 60% de los
alimentos que consumimos.
La Unión Europea ha establecido un marco legal que regula el empleo, la
liberación al medio ambiente y sobre todo, el etiquetado de los productos
alimenticios que contienen estos organismos.
El TaqMan® GMO Screening kit, permite analizar la presencia de ADN
transgénico mediante la detección de tres regiones reguladoras presentes en
los organismos modificados genéticamente aprobados por la UE.
Este kit emplea tecnología Real-Time PCR y contiene todos los reactivos
necesarios para llevar a cabo la detección de OMG en ADN obtenido a partir de
cualquier alimento o pienso. Además, el kit contiene un Control Positivo Interno
(IPC) que permite identificar la presencia de inhibición durante el proceso de
PCR.
Rev. 08-03-2011
2/12
2. Descripción del kit
El TaqMan® GMO Screening kit permite detectar todos los eventos
transgénicos aprobados en la Unión Europea, así como la mayoría de los
eventos descritos en las bases de datos mundiales.
El promotor 35S obtenido a partir del virus de mosaico de la coliflor (CaMV) y el
terminador NOS procedente de Agrobacterium tumefaciens, son los elementos
reguladores que se han analizado tradicionalmente para el cribado de material
transgénico en alimentos. Actualmente, estos elementos reguladores no cubren
eventos transgénicos tan importantes como la soja MON89788, la remolacha
H7-1 o la colza GT73. Con el objetivo de disponer del mayor espectro de
detección, el TaqMan® GMO Screening kit, incluye el promotor 34S del Figwort
Mosaic Virus (FMV), además de las regiones reguladoras P35S y TNOS
Los elementos reguladores presentes en los OMG se encuentran de forma
natural en los organismos de los que proceden (CaMV, A. tumefaciens y FMV).
Por este motivo, el empleo de regiones reguladoras suscita controversia a la
hora de interpretar un resultado positivo. TaqMan® GMO Screening kit,
incorpora la detección simultanea de una región genómica exclusiva de estos
tres organismos que permite discriminar de forma inequívoca si un resultado
positivo se debe a la presencia de material modificado genéticamente o se debe
a la presencia natural de estos organismos.
Para llevar a cabo el análisis de cada muestra, se realizan cuatro reacciones de
PCR a tiempo real. En cada una de estas reacciones se amplifican dos regiones
independientes mediante una única reacción de PCR multiplex, empleando dos
canales del termociclador (FAM y VIC). A continuación se describen las
reacciones de amplificación:
P35S/CaMV: En esta reacción hay dos sondas tipo TaqMan® una esta
marcada con el fluoróforo FAM y detecta amplificados del elemento
regulador P35S del virus CaMV y la otra sonda esta marcada con VIC para
detectar un amplificado espécifico del virus CaMV.
TNOS/A. tumefaciens: La reacción incluye dos sondas TaqMan®. Una
de ellas está marcada con el fluoróforo FAM y detecta amplificados del
elemento regulador TNOS procedente de A. tumefacines. La otra sonda
esta marcada con VIC y detecta amplificados procedentes de una región
genómica exclusiva de esta bacteria.
Rev. 08-03-2011
3/12
P34S/FMV: La reacción incluye dos sondas TaqMan®. Una de ellas está
marcada con el fluoróforo FAM y detecta amplificados del elemento
regulador P34S procedente del virus FMV. La otra sonda esta marcada con
VIC y detecta amplificados procedentes de una región genómica exclusiva
de este virus.
Vegetal/IPC: La reacción incluye dos sondas TaqMan®. Una de ellas está
marcada con el fluoróforo FAM y detecta ADN vegetal. La otra sonda esta
marcada con VIC y detecta un Control Positivo Interno, que utilizaremos
para descartar la presencia de inhibidores en la muestra.
Se ha verificado que el límite de detección de la PCR es de 5 copias de ADN por
reacción para todas las regiones analizadas con este kit.
Este kit permite detectar estándares certificados que contengan un porcentaje
igual o inferior al 0,1% de diferentes eventos y especies vegetales transgénicas.
3. Componentes y almacenamiento del kit
Este kit contiene los reactivos necesarios para la realización de 48
determinaciones de cada una de las regiones analizadas (ver apartado
anterior):
REACTIVOS
Identificación
Cantidad
Conservación
Master Mix P35S
Disco rojo
400 μl
-20ºC
Master Mix TNOS
Disco azul
400 μl
-20ºC
Disco amarillo
400 μl
-20ºC
Master Mix Vegetal
Disco verde
400 μl
-20ºC
Master Mix General
Disco blanco
3 x 880 μl
4ºC
Tapón naranja
100 μl
-20ºC
Master Mix P34S-FMV
Control Positivo
Rev. 08-03-2011
4/12
4. Listado de equipamiento necesario
La siguiente tabla muestra el equipamiento necesario para utilizar el TaqMan®
GMO Screening Kit:
EQUIPAMIENTO NECESARIO
1
Termociclador Real-time PCR con canales de detección para los
fluoróforos FAM (520 nm) y VIC (550 nm)
2
Juego de micropipetas (10, 20 y 200 ul)
3
Centrífuga de sobremesa con adaptadores para placas de 96 y/o
tubos
4
Vortex
5. Listado de material fungible necesario
La siguiente tabla muestra el material fungible necesario para utilizar el
TaqMan® GMO Screening Kit:
MATERIALES
1
Placas de PCR ópticas aptas para el termociclador empleado o tubos
ópticos de 0,2 ml
2
Films ópticos para cubrir las placas de PCR o tapas ópticas para los
tubos empleados
3
Puntas con filtro desechables para micropipetas
4
Tubos estériles de 1,5 ml
5
Guantes de látex sin talco
Rev. 08-03-2011
5/12
6. Preparación de las reacciones de amplificación
El TaqMan® GMO Screening kit está diseñado para realizar cuatro
reacciones por cada muestra que se desea analizar (P35S, TNOS, P34S-FMV y
Vegetal).
Para estimar la cantidad de reactivos necesaria, se debe tener en cuenta el
número de muestras y controles a analizar simultáneamente. Recomendamos
realizar los cálculos, considerando una reacción más, o bien, incrementando un
10% el volumen de cada reactivo.
Se prepararán 4 masters de PCR distintos; uno para cada región analizada. A
continuación se muestra el protocolo recomendado para la preparación de las
reacciones de amplificación:
1. Descongelar los Master Mix (consultar página 5), el Control Positivo y los
ADNs de las muestras (en caso de que se conserven congelados).
2. Dar un vórtex a cada uno de los reactivos y mantener en frío.
3. En un tubo de 1,5 ml, añadir 7,5 μl del Master Mix por cada una de las
reacciones.
4. Añadir 12,5 μl del Master Mix General a cada una de las reacciones. Dar un
vórtex y pipetear 20 μl en cada pocillo o tubo.
5. Añadir 5 μl del ADN (10-25 ng/μl) de las muestras en los pocillos
correspondientes.
6. Añadir 5 μl del Control Positivo y de los controles negativos en los pocillos
correspondientes.
7. Tapar la placa con film óptico y dar un spin.
Rev. 08-03-2011
6/12
7. Programa de amplificación
Someter las reacciones
amplificación:
de
amplificación
al
siguiente
Temperatura
Tiempo
Ciclos
95ºC
10 minutos
1
95ºC
15 segundos
60ºC
1 minuto
programa
de
50
Nota: Este programa ha sido validado en un equipo StepOne Real-Time PCR
System de Applied Biosystems. Si se emplea en otra marca o modelo de
termociclador, es posible que se deba ajustar el programa de amplificación.
Póngase en contacto con nuestro servicio técnico si necesita recibir
asesoramiento.
Rev. 08-03-2011
7/12
8. Análisis de los resultados
Antes de analizar los resultados de las muestras, se debe comprobar que el
resultado obtenido en los diferentes controles es el esperado:
ƒ
Control Positivo: El resultado debe ser siempre positivo en todas las
reacciones de amplificación, tanto en el canal de FAM como en de VIC.
ƒ
Controles negativos: Únicamente se debe detectar amplificación en
el canal de VIC de la reacción realizada con el Master Mix Vegetal. En
este canal se detecta un control interno positivo (IPC) que determina la
ausencia de inhibición en la muestra.
Vegetal/IPC
Se deberá comprobar en todas las muestras que el IPC (VIC) es positivo, y
que el Ct en el que se detecta es similar al del Control Positivo. Un resultado
negativo en el IPC indica la presencia de inhibidores en la muestra. Se debe
tener en cuenta que es posible que el resultado del IPC sea negativo en
muestras donde se detecta en una gran cantidad de ADN vegetal (FAM),
debido a que los reactivos de la PCR se agotan antes de iniciarse la
amplificación del IPC.
P35S/CaMV
La amplificación de P35S (FAM) junto con la ausencia de amplificación del
CaMV (VIC) indica la presencia de material transgénico en la muestra. Si se
detecta amplificación tanto para P35S como para CaMV indica que en la
muestra esta presente el virus CaMV y, en este caso, no se puede determinar
si la muestra contiene material transgénico ya que no es posible discriminar si
el promotor 35S procede del CaMV, presente de forma natural en la muestra,
o bien, procede del material modificado genéticamente.
TNOS/A. tumefaciens
La amplificación de TNOS (FAM) junto con la ausencia de amplificación de A.
tumefaciens (VIC) indica la presencia de material transgénico en la muestra.
Si se detecta amplificación tanto para TNOS como para A. tumefaciens indica
que en la muestra esta presente bacteria Agrobacterium tumefaciens y, en
este caso, no se puede determinar si la muestra contiene material transgénico
ya que no es posible discriminar si el terminador NOS procede de la bacteria,
presente de forma natural en la muestra, o bien, procede del material
modificado genéticamente.
Rev. 08-03-2011
8/12
P34S/FMV
La amplificación de P34S (FAM) junto con la ausencia de amplificación del
virus FMV (VIC) indica la presencia de material transgénico en la muestra. Si
se detecta amplificación tanto para P34S como para FMV indica que en la
muestra está presente el virus y, en este caso, no se puede determinar si la
muestra contiene material transgénico ya que no es posible discriminar si
P34S procede del virus, presente de forma natural en la muestra, o bien,
procede del material modificado genéticamente.
En las muestras donde no hay amplificación en las reacciones de P35S, TNOS
y P34S (FMV) se puede concluir que no se ha detectado la presencia de
material transgénico.
En la siguiente tabla se representan gráficamente los resultados que se
pueden obtener a partir del análisis de una muestra, así como la
interpretación que se debe hacer a partir del resultado obtenido:
Master Mix
Vegetal
Master Mix
P35S
Master Mix
TNOS
Master Mix
P34S-FMV
INTERPRETACIÓN
Veg.
IPC
P35S
CaMV
TNOS
A. tum
P34S
FMV
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
+
-
-
-
-
-
+
+
-
-
+
-
-
-
+
+
-
-
-
-
+
-
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
No se ha detectado material
transgénico.
Se ha detectado material
transgénico que contiene P35S
Se ha detectado material
transgénico que contiene TNOS
Se ha detectado material
transgénico que contiene P34S
Se ha detectado la presencia
de CaMV
Se ha detectado la presencia
de A. tumefaciens
Se ha detectado la presencia
de FMV
Presencia de inhibidores de la
PCR en la muestra*
-
+
-
-
-
-
-
-
Muestra sin ADN vegetal
+
-
-
-
-
-
-
-
Muestra con una gran cantidad
de ADN vegetal
*
Si se detecta la presencia de inhibidores en la muestra, le aconsejamos que
verifique si se ha puesto un exceso de ADN en la reacción (la cantidad máxima
aconsejable es de 250 ng). Si la cantidad de ADN es correcta, le aconsejamos
repetir la extracción del ADN empleando un nuevo protocolo (contacte con
nuestro departamento técnico si precisa asesoramiento).
Rev. 08-03-2011
9/12
En la siguiente tabla se representan gráficamente los resultados que se
pueden obtener a partir del análisis de diferentes controles del ensayo, así
como la interpretación que se debe hacer a partir del resultado obtenido:
Master Mix
Vegetal
Veg
IPC
Master Mix
P35S
Master Mix
TNOS
Master Mix
P34S-FMV
P35S
CaMV
TNOS
A. tum
P34S
FMV
INTERPRETACIÓN
Control Positivo
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
1
Resultado esperado
Resultado esperado
Fallo en la amplificación
Control Negativo de Extracción
-
+
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
+/-
-
+/-
-
+/-
-
Contaminación de la
extracción con material vegetal
3
Contaminación con material
transgénico
Resultado esperado
2
Control Negativo de PCR
-
+
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
+/-
-
+/-
-
+/-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
4
Contaminación de la
extracción con ADN vegetal
5
Contaminación con ADN de
material transgénico
6
Contaminación, posiblemente
con el Control Positivo
Recomendaciones:
1
Revise el programa de amplificación y la configuración de la captura de fluorescencia. El fallo
en la amplificación puede deberse a un problema técnico de configuración.
2-3
La contaminación puede deberse a algún error cometido en el proceso de manipulación de
las muestras, contaminación de los reactivos o contaminación ambiental. Revise el protocolo
de extracción de ADN, limpie a fondo el laboratorio donde se lleva a cabo el proceso de
extracción de ADN y extreme las precauciones para evitar cualquier contaminación durante el
proceso de homogeneización de las muestras. Si lo considera necesario, utilice nuevas
alícuotas de los reactivos empleados en la extracción de ADN.
4-5
La contaminación de las reacciones de PCR puede a algún error cometido en el proceso de
manipulación de las muestras, contaminación de los reactivos empleados o contaminación
ambiental. Limpie a fondo el laboratorio donde se lleva a cabo el proceso de PCR y sus
equipos. Si lo considera necesario, utilice nuevas alícuotas de los reactivos empleados en la
PCR.
6
Prepare la reacción de PCR que contiene el Control Positivo en último lugar para evitar
contaminaciones cruzadas. Limpie a fondo el laboratorio donde se lleva a cabo el proceso de
PCR y sus equipos. Si lo considera necesario, utilice nuevas alícuotas de los reactivos
empleados en la PCR.
Rev. 08-03-2011
10/12
9. Control de calidad
Todos los productos comercializados por el Instituto de Medicina Genómica son
sometidos a un riguroso control de calidad. El TaqMan® GMO Screening kit
ha superado todas las pruebas de validación internas, que garantizan la
fiabilidad y reproducibilidad de cada ensayo.
Puede consultar el Certificado de Análisis correspondiente a su kit,
introduciendo el número de lote del producto en la sección de Kits de Análisis
de la web www.imegen.es.
10. Garantías y responsabilidades
El Instituto de Medicina Genómica le garantiza que todos sus productos están
libres de defectos, tanto en los materiales empleados como en su proceso de
su fabricación. Esta garantía se hace extensible a un período de un año desde
la fecha de envío del producto, siempre que se observen las condiciones de
conservación especificadas en este Manual. Nuestros productos están
diseñados para uso en investigación. El usuario de los productos es
responsable de validar la utilidad de los protocolo propuestos por el Instituto
de Medicina Genómica. Dichos protocolos se consideran únicamente una guía.
El Instituto de Medicina Genómica no le ofrece ninguna otra garantía, expresa
o implícita, que se extienda más allá del funcionamiento correcto de los
componentes de este set. La única obligación del Instituto de Medicina
Genómica, respecto de las garantías precedentes, será la de reemplazar los
productos, o bien devolver el precio de la compra de los mismos, a voluntad
del cliente, siempre y cuando se pruebe la existencia de un defecto en los
materiales, o bien en la elaboración de sus productos. El Instituto de Medicina
Genómica no será responsable de ningún daño, directo o indirecto, que resulte
en pérdidas económicas o en daños que pudieran producirse por el uso de
este producto por parte del comprador o usuario.
13. Servicio de atención al cliente
Para cualquier consulta sobre las aplicaciones de este producto o sobre sus
protocolos, puede contactar con nuestro Departamento Técnico:
Teléfono: 963 212 340
Mail: info@imegen.es
Rev. 08-03-2011
11/12